热原是微生物的代谢产物,即能引起恒温动物和人体体温异常升高的致热物质,包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这些物质进入血液后被吞噬细胞吞噬而产生内源性致热原(内热原),作用于下丘脑体温调节中枢,结果使动物体温上升,引起发热等一系列不良反应,必须严格控制。
除另有规定外,《中国药典》二部规定了静脉用注射剂均需进行热原或细菌内毒素的检查。细菌内毒素检查和热原检查是目的相同的不同检验方法,热原检查采用家兔法,细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
一、热原的家兔检查法
《中国药典》二部采用家兔法检查热原,将一定剂量的供试品静脉注入家兔体内,在规定时间内观察家兔体温升高的情况,以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。给家兔注射一定量的热原后,一般15～30分钟体温开始上升,70～120分钟达到最高峰。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、实验室条件和操作的规范性。
(一)试验动物
热原检查的试验动物为家兔,应符合:①健康合格,体重1.7kg以上,雌兔应无孕。预测体温前7日应用同一饲料喂养,在此期间内,体重应不减轻,精神、食欲、排泄等不得有异常现象。②对未曾用于热原试验的家兔;或供试品判定为符合规定,但组内升温达0.6℃的家兔;或3周内未曾使用的家兔均应在试验前3～7日内预检体温,进行挑选。挑选试验条件与检查供试品时相同,仅不注射药液,每隔30分钟测温1次,连续测4小时,共测8次。4小时内各兔体温均在38.0~39.6℃,且最高最低温差不超过0.4℃者,方可供试验用。③凡热原试验用过的家兔,如供试品判为符合规定,至少休息48小时后可重复使用。其中升温达0.6℃的家兔应休息2周以上。④如热原检查不合规定时,则组内全部家兔不能再使用。每一家兔的使用次数,用于一般药品的检查应不超过10次。
(二)检查前的准备工作
实1.每批供试品初试用3只,复试用5只家兔。在检查前1～2日,供试用家兔应分别为能处于同一温度的环境中,实验室和饲养室的温度相差不得大于3℃,实验室的温度0.4℃、 在17～25℃,在试验全过程中,应注意室温变化不得大于3℃,应防止动物骚动并避免解声干扰。
2.家兔在试验前至少1小时开始停止给食,并置于宽松适宜的装置中,直至试验
完毕。测量家兔体温应使用精密度为±0.1℃的测温装置。测温探头或肛温计插人
的深度和时间各兔应相同,深度一般约6cm,间不得少于1分半钟,每隔30分钟测量体温1次,一般测量2次,两次体温之差不得超过0.2℃,以此两次体温的平均值作为1兔的正常体温。当日使用的家免,正常体温应在38.0～39.6℃,且同组各兔间正常体肛门内之差不得超过1℃。
3.试验用的注射器、针头及一切和供试品接触的器皿,应置烘箱中于250℃加热2.分钟,或用180℃加热2小时,也可用其他适宜的方法除去热原。
(三)检查方法
1.测家兔正常体温后15分钟内,自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38可采用供试品溶液,然后每隔30分钟测量体温1次,连续测6次。
2.每只兔的正常体温与注射供试品溶液后6次测量体温中最高的体温之差即为该兔体温的升高温度。
(四)结果判定
1.符合下列情况者,判为符合规定在初试3只家兔中,体温升高均低于0.6℃,并且3只家兔体温升高总和低于1.3℃;或在复试的5只家兔中,体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔不超过1只,并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或3.5℃以下。
2.有下列情况之一者,复试一次3只家兔中1只体温升高0.6℃或0.6℃以上;3只家兔升温均低于0.6℃,但3只家兔升温总和达1.3℃或1.3℃以上。
3.有下列情况之一者,判为不符合规定在初试3只家兔中,体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只;或在复试的5只家兔中,体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只;或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5℃。
4.出现负值的规定如下当家兔升温为负值时,均以0℃计。
(五)注意事项
1.建议应尽量使用热原测温仪测温,因为其感温探头在整个测温过程中都置于兔门内,兔较安静,所测体温较正确,同时也避免了给药后1小时、2小时、3小时测温这项规定造成的漏检现象。
2.热原的耐热性能良好,60℃加热1小时不被分解破坏,100℃不降解,但180℃3-4小时、200℃60分钟或250℃30～45分钟可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其他用具以及注射时使用的注射器等,均可采用此法破坏热原。
3.热原实验室内外应保持安静,避免强烈直射的日光或灯光及其他刺激。室温应为17～25℃,且在全部试验过程中,室温变化不得大于3℃
4.有的供试品如腺苷三磷酸二钠注射时要注意速度应缓慢,否则易造成家兔死亡。
5.试验过程中,要及时填写兔卡及原始记录。
二、细菌内毒素的鲎试剂检查法
细菌内毒素检查法又称鲎试剂法,是利用鲎试剂与细菌内毒素发生凝集反应,以检测或量化药品中因革兰阴性菌产生的细菌内毒素含量是否符合规定的一种方法。此法以其快速、灵敏、经济、重现性好等特点得到了日益广泛的应用,并有取代传统的热原检查法的发展趋势。
1956年,美国动物学家Bang首先发现,给美洲鲎注入革兰阴性细菌后引起全身性
血液凝固。1968年,美国血液工作者Dr r. Levin与Bag初步阐明这种血液凝固是由于革兰阴性细菌内毒素激活了鲎血变形细胞溶解物的酶,使溶解物中的可溶性蛋白变成凝胶。这种凝固反应极其灵敏,当内毒素浓度达0001ug/ml即足以产生阳性结果。20世19纪70年代,美国提取变形细胞溶解物制成试剂,创建了检测微量内毒素的检测技术。
细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者又包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
(一)标准品
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
(二)检查前的准备工作
1.试验器材处理试验所用的器皿需经处理,去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干燥至少30分钟,也可用其他确保不干扰细菌内毒素检查的适
宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
2.供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH在6.0～8.0。
3.内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按式 L=K/M确定。
式中,l为供试品的细菌内毒素限值,以EU/ml、EU/mg或EUU(活性单位)表示;K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(gh)表示;M为人用每千克体重每小时最大供试品剂量,以m(kgh)、m/(kgh)或U/(kgh)表示,人均体重按60kg计算,注射时间若不足1小时,按1小时计算。
4.确定最大有效稀释倍数(MVD)最大有效稀释倍数(MVD)是指供试品溶液被
允许稀释的最大倍数,在不超过此稀释倍数下可进行内毒素限值的检测。一般按式MVD=CL/λ确定 。
式中,L为供试品的细菌内毒素限值;C为供试品溶液的浓度,当L以EU/ml表示时,则C等于1.0ml/ml,当L以EU/mg或EU/U表示时,C的单位需为mg/ml或U/ml为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
(三)检查方法凝胶法
凝胶法是一种限量法,是经典的细菌内毒素检查法。凝胶法系指通过鲨试剂与内0毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。在本检查法规定的条件下,使截试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为试剂的标示灵敏度,用Eml表示
1.试剂灵敏度复核试验当使用的试剂批号改变或试验条件发生了改变可能会影响检验结果时,需要进行试剂灵敏度复核试验。在细菌内毒素检查法规定的条件下,能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度称为灵敏度。单位为EU/ml。常用鲎试剂的灵敏度:0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml。
根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ共4个浓度的内毒溶液。《中国药典》二部要求将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解后需要在旋涡混合器上混匀15分钟,以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。
在16支试管中分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液,即每一个浓度平行做4支试管;在2支试管中加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入37℃±1℃适宜恒温器中,保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程中应避免受到振动,造成假阴性结果。
若最大浓度2管均为阳性,最低浓度0.5管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按式计算反应终点浓度的几何平均值,即为试剂灵敏度的测定值(λc)
式中
,为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λ在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。
2.干扰试验内毒素试验是试剂在无干扰的条件下与内毒素的一种凝集反应,当进行新药的内毒素检查试验前,或无细菌内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时须进行干扰试验;当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。试验方法如下。
(1)按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液,按照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
(2)当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性,并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。
(3)按式
计算C和B
式中
,为系列溶液C的反应终点浓度的对数值(lg)为系列溶液B的反应终点浓度的对数值(lg)
当E在0.5-2(包括0.5A和20及E在0.5E,-2E(包括0.5E,和2E)时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MD的稀释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释,再重复干扰试验。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效排除干扰且不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
3.凝胶限量试验按表2制备溶液A、B、C、D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。
(四)结果判定
保温60分钟±2分钟后观察结果。
1.若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照B的平行管均为阳性阳性对照溶液C的平行管均为阳性,试验有效。
2.若溶液A的两个平行管都为阴性,判供试品符合规定。
3.若溶液A的两个平行管均为阳性,判供试品不符合规定。
4.若溶液A的两个平行管中的一管为阳性,另一管为阴性,需进行复试。复试时溶液A需做4支平行管,若所有平行管均为阴性,定供试品细菌内毒素符合规定否则判定供试品细菌内毒素不符合规定。
(五)注意事项
1.试剂生物活性在pH6.0～8.0时酶活性稳定,pH≤3或≥10时,酶活性受到抑制,故试验时,供试品溶液pH应调节至6.0～8.0
2.试验操作过程应防止微生物的污染,水浴保温时应避免强烈震动。混合时应使用旋涡混合器,注意试管一定要垂直于插盘。试管溶液最好以不超过试管高度的1/3为宜。
(六)热原检查法和细菌内毒素检查法应用范围比较
热原检查法(家兔法)可用于检测内毒素热原和非内毒素热原产生的热原反应;细菌内毒素检查法(鲎试剂法)只检测细菌内毒素含量。
家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况,但操作烦琐费时,不能用于注射剂生产过程中的质量监控,且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏10倍,操作简单易行,试验费用低,结果迅速可靠,适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂,但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏,目前尚不能完全代替家兔法。
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