第四节 校准曲线
校准曲线包括标准曲线和工作曲线，前者用标准溶液系列直接测量，没有经过预处理过程，这对于样品往往造成较大误差;而后者所使用的标准溶液经过了与样品相同的消解、净化、测量等全过程。
凡应用校准曲线的分析方法，都是在样品测得信号值后，从校准曲线上查得其含量(或浓度)。因此，绘制准确的校准曲线，直接影响到样品分析结果的准确与否。此外，校准曲线也确定了方法的测定范围。
1.校准曲线的绘制
用一系列被测物标准溶液，按照标准方法规定的步骤，将被测物转变为有色溶液。制备好的标准系列和空白，在方法选定的波长下，测定吸光度。已被测物浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制校准曲线。
1)对标准系列，溶液以纯溶剂为参比进行测量后，应先作空白校正，然后绘制标准曲线;
2)标准溶液一般可直接测定，但如试样的预处理较复杂致使污染或损失不可忽略时，应和试样同样处理后再测定。
3)校准曲线的斜率常随环境温度、试剂批号和贮存时间等实验条件的改变而变动。因此，在测定试样的同时，绘制校准曲线最为理想，否则应在测定试样的同时，平行测定零浓度和中等浓度标准溶液各两份，取均值相减后与原校准曲线上的相应点核对，其相对差值根据方法精密度不得大于5%～10%，否则应重新绘制校准曲线。
2. 校准曲线的检验
1)线性检验: 即检验校准曲线的精密度。对于以4～6个浓度单位所获得的测量信号值绘制的校准曲线，分光光度法一般要求其相关系数 | r | ≥0.9990，否则应找出原因并加以纠正，重新绘制合格的校准曲线。
2)截距检验：即检验校准曲线的准确度，在线性检验合格的基础上，对其进行线性回归，得出回归方程 y= a+bx ，然后将所得截距a与0作t检验，当取95%置信水平，经检验无显著性差异时，a可做0处理，方程简化为y= bx，移项得x=y/b。在线性范围内，可代替查阅校准曲线，直接将样品测量信号值经空白校正后，计算出试样浓度。
当a与0有显著性差异时，表示校准曲线的回归方程计算结果准确度不高，应找出原因予以校正后，重新绘制校准曲线并经线性检验合格。在计算回归方程，经截距检验合格后投入使用。
回归方程如不经上述检验和处理，就直接投入使用，必将给测定结果引入差值相当于解决a的系统误差。
3) 斜率检验: 即检验分析方法的灵敏度，方法灵敏度是随实验条件的变化而改变的。在完全相同的分析条件下，仅由于操作中的随机误差导致的斜率变化不应超出一定的允许范围，此范围因分析方法的精度不同而异。例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相对差值小于5%，而原子吸收分光光度法则要求其相对差值小于10%等等。
3. 校准曲线的控制
被测物转变为有色溶液的反应称为显色反应或发色反应。显色反应的介质PH条件、显色剂用量、显色反应的时间和温度、为消除共存物干扰而加入的掩蔽剂、甚至加试剂的顺序，都要按照方法步骤的要求执行。有时，标准系列虽然不像实际试样那样组成复杂，但仍要求与试样进行同样的处理步骤，以便控制校准曲线上的数据点的空白、回收率等因素。
建立校准曲线时，测量吸光度的参比有两种选择。
第一种方法用纯溶剂作参比，两个比色皿都放溶剂时，“样品比色皿” 的吸光度测定值为比色皿成对性校正值，此后所有样品吸光度测定值都须扣除此值，进行校正。然后，以纯溶剂为参比，测定空白及标准系列的吸光度，绘制校准曲线。
第二种方法直接用空白为参比。当两个比色皿都放空白时，测定比色皿成对性校正值，然后测定标准系列的吸光度，绘制校准曲线。两种方法得到的两条校准曲线互相平行，但第一种方法可测定空白的水平，后一种方法不能测定空白，理论上校准曲线通过原点。若空白为零，两条校准曲线重合。无论用什么作参比，实样测定时应该使用与建立校准曲线相同的比色皿和同样的参比。
比色皿的成对性校正对于使用已久的比色皿是必要的，尤其是测量吸光度很小的样品时，校正可保证测量值的可靠性和重复性。
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