其基本方法如下。
(1) 引物设计。
R 12 5’2 GA TCTGCGGTGA 23’
R 24 3’2 ACGCCACTCTCCGACCTCTCACGA 25’
J 12 5’2 GA TCTGTTCA TG23’
J 24 3’2 ACAA GTACCTA TCA GCTGCA GCCA 25’
N 12 5’2 GA TCTTCCCTCG23’
N 24 3’2 AA GGGA GCCTA TCGTGTCAACGGA 25’
DpnII 酶切双链cDNA 产生粘性末端, R 24 和R12、J 24 和J 12、N 24 和N 12 退火后两两互补可形成DpnII 的酶切位点。3 对接头(引物) 中, 1 对(可用R24、R 12) 制备扩增子, 另外2 对用于杂交和扩增的过程中。在相连的两轮PCR 反应中, 不能使用相同的1对接头, 否则上轮反应中未酶切完全的非靶序列(非差异片断) 仍会部分扩增, 从而影响靶序列的纯度。
(2) 提取处理组和对照组的mRNA , 反转录成cDNA。
(3) 用识别4 个碱基的内切酶Dpn II(M bo I) 在37℃将两组双链cDNA 充分酶切。
(4) 纯化经Dpn II酶切的cDNA , 加入R24、R12 及DNA 连接酶连接。
(5) 以R24 为引物分别扩增处理组和对照组。
(6) 纯化扩增产物分别用Dpn II 充分酶切, 切掉R24 的接头, 即得到扩增子作为D river。
(7) 更换接头, 连接J 24、J 12 到扩增子, 建立1 个试验者群体。
(8) Tester以1∶100 分子比例与D river 混合, 在95～ 96℃变性4 m in, 67℃杂交至少21 h, 在两cDNA 群体间成对比较(例如群体A →B) , 同时作A →B 和B→A 两种比较效果更好。杂交有TesteröD river、D riveröD river、TesteröTester 3 种结果。
(9) 用J 24 引物PCR 扩增, TesteröD river 杂交体只能以单引物扩增, 产物数量呈线性递增, 产物均为单链DNA , TesteröTester 杂交体可以被扩增, 分子数呈指数递增, 且为dsDNA 分子, D riveröD river 杂交体由于没有J 24 引物退火区域, 不能进行PCR 扩增, 产物用M ung Bean N uclease 处理, 去除单链DNA 分子, 差异cDNA 完成了第一轮富集。
(10) 第一轮富集产物用Dpn II 酶切掉R 24 接头连上N 12、N 24 接头, 按1∶400 比例与D river 杂交、扩增,M ung BeanN uclease 消化单链DNA , 实现第二轮差异cDNA的富集, 如实验需要可进行第三、四轮杂交(1 ∶800)。
(11)No rthern b lo t 分析, 排除假阳性片段, 来自差异cDNA 的片段进行克隆, 检测表达分析。
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