高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为2.1～4.6mm,填充剂粒径约为2～10µm。超高效液相色谱仪是耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
(1)色谱柱
反相色谱柱:以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基硅烷键合硅胶等。
正相色谱柱:用硅胶填充剂,或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱:用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱:用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径与长度,填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量,填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能,应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果,品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温,应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当调整色谱柱的温度。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱,流动相pH值一般应在2～8之间。烷基硅烷带有立体侧链保护、或残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相,可用于pH值小于2或大于8的流动相。
(2)检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器,包括二极管阵列检测器,其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、电雾式检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器,其响应值不仅与被测物质的量有关,还与其结构有关；蒸发光散射检测器、电雾式检测器和示差折光检测器为通用检测器,对所有物质均有响应；结构相似的物质在蒸发光散射检测器和电雾式检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系；蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系,一般需经对数转换；电雾式检测器的响应值与被测物质的量通常也呈指数关系,一般需经对数转换或用二次函数计算,但在小质量范围内可基本呈线性。
不同的检测器,对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法(通则0401)项下对溶剂的要求；采用低波长检测时,还应考虑有机溶剂的截止使用波长。蒸发光散射检测器、电雾式检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性成分的流动相。
(3)流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统或乙腈-水系统,用紫外末端波长检测时,宜选用乙腈-水系统。流动相中如需使用缓冲溶液,应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时,流动相中有机溶剂一般应不低于5%,否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。
正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂,如二氯甲烷和正己烷等。
流动相注入液相色谱仪的方式(又称洗脱方式)可分为两种:一种是等度洗脱,另一种是梯度洗脱。用梯度洗脱分离时,梯度洗脱程序通常以表格的形式在品种项下规定,其中包括运行时间和流动相在不同时间的成分比例。
(4)色谱参数调整 品种正文项下规定的色谱条件(参数),除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外,其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等,均可适当调整。
若需使用小粒径(约2µm)填充剂和小内径(约2.1mm)色谱柱或表面多孔填充剂以提高分离度或缩短分析时间,输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配,必要时,色谱条件(参数)可适当调整。
色谱参数允许调整范围见表。
可通过相关软件计算表中流速、进样体积和梯度洗脱程序的调整范围,并根据色谱峰分离情况进行微调。
调整后,系统适用性应符合要求,且色谱峰出峰顺序不变。若减小进样体积,应保证检测限和峰面积的重复性；若增加进样体积,应使分离度和线性关系仍满足要求。应评价色谱参数调整对分离和检测的影响,必要时对调整色谱参数后的方法进行确认。若调整超出表中规定的范围或品种项下规定的范围,被认为是对方法的修改,需要进行充分的方法学验证。
调整梯度洗脱色谱参数时应比调整等度洗脱色谱参数时更加谨慎,因为此调整可能会使某些峰位置变化,造成峰识别错误,或者与其他峰重叠。
当对调整色谱条件后的测定结果产生异议时,应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
在品种项下一般不宜指定或推荐色谱柱的品牌,但可规定色谱柱的填充剂(固定相)种类(如键合相,是否改性、封端等)、粒径、孔径,色谱柱的柱长或柱内径；当耐用性试验证明必须使用特定品牌的色谱柱方能满足分离要求时,可在该品种正文项下注明。
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