为了定量地表达受纳水体的污染负荷与生物学效应之间的关系,可以在适当控制的条件下,把受试鱼类放入含不同浓度的已知或未知毒物的水体中,观察和记录鱼类的各种反应,这就是鱼类毒性试验。由于鱼类对水环境的变化反应十分敏感,当水体中的污染物达到一定强度时,就会引起一系列中毒反应,如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变直至死亡。因此,鱼类毒性试验常用作检测水体污染的有效方法。
(1)试验鱼的选择和驯养 在选择试验鱼的种类时,一般考虑鱼的下述性状和特点:敏感度高,代表性强,取材方便,大小适中,在室内条件下易于饲养和繁殖。实验用鱼必须健康无病、行动活泼,其外观体色发亮、鱼鳍完整舒展,逆水性强,食欲强。鱼的大小和品种都可能导致对毒物敏感度不同,因此在同一试验中,要求试验鱼必须同种、同龄、同一来源。个体应尽可能大小一致,个体以长不超过5~8cm为宜,最大个体不可大于最小个体的50%。
试验鱼必须经过驯养。驯养的目的是使鱼类适应实验室的生活环境,并对试验鱼进行健康选择。驯养时间为7~15d。驯养用水(水温、水质等)必须与试验用水一致。驯养期间,鱼的死亡率不得大于5%,否则该批鱼不得用于试验。此外,正式试验的前一天应停止喂食,因为喂食会增加鱼的呼吸代谢和排泄物,影响试验液的毒性。
(2)实验准备 每个试验浓度为一组,每组至少10尾鱼。为便于观察,容器采用玻璃缸,每升水中鱼重不超过2g。
①试验液中的溶解氧。溶解氧是鱼类生存的必要条件。对于温水性鱼类试验溶解氧含量不得低于4mg/L;对于冷水性鱼类,不得低于5mg/L。如果受试物质本身耗氧量大,则应采取措施补充水中的溶解氧,可采取更换试验液或有控制地对试验液充氧,使试验在氧充足的条件下进行。
②试验液的温度。试验期间应保持鱼类原来的适应温度。一般来说,温水性鱼类要求水温在20~28℃,冷水性鱼类要求水温在12~18℃。
水温对受试物质的毒性有一定的影响,一般温度高时毒性大。因此,为了使试验结果可靠,在同一试验中,温度的波动为±2℃。对于比较严格的试验,推荐(25±1)℃作为温水性鱼类的标准水温,(15±1)℃作为冷水性鱼类的标准水温。
③试验液的pH值。试验液的pH值与生物的代谢有密切关系;另一方面,pH值可能影响某些毒物的离子化,也可能影响其溶解度此外,pH值对氨和氰化物的影响特别明显。所以在毒性试验中,应维持pH值在鱼类的适应范围之内,即pH=6.5~8.5,试验期间,pH值的波动范围不得超过0.4个pH值单位。
④试验液的硬度。一般来说,硬水可降低毒物毒性,而软水可增强毒性。因此,必须注意检测试验液的硬度值,并在报告中注明。硬度在(以CaCO3计)50~250mg/L之间均可。如果硬度过大,可用配比法适当调整。
(3)试验步骤
①预备试验。为保证正式试验顺利进行,必须先进行探索性预备试验,以观察试验鱼的中毒表现和选择观察指标,确定正式试验的大致浓度范围,检验规定的试验条件是否合适。该试验的浓度范围可适当大些每组鱼的尾数是3~5个,观察24~48h内鱼类中毒反应和死亡情况,从最高全存活浓度和最低全死亡浓度之间选择下一步正式试验的浓度范围。
②正式试验浓度设计和毒性判断。合理设计试验浓度,对试验的成功和精确有很大影响。在试验中通常要选7个浓度(至少5个),浓度间取等对数间距,它既可代表体积分数比,也可代表mg/L或μg/L。例如,10.0、5.6、3.2、1.8、1.0(对数间距0.25)或10.0、7.9、6.3、5.0、4.0、3.6、2.5、2.0、1.6、1.26、1.0(对数间距0.1)。另设一对照组,对照组在试验期间鱼死亡率不得超过10%,否则整个试验结果就不能采用。
试验开始的前8个小时应连续观察和记录,如果正常,则继续试验,做第24h、48h和96h的观察记录。试验过程发现特异变化应随时记录,根据鱼的死亡情况、中毒症状判断毒物或工业废水毒性大小。如毒物的饱和溶液或所试工业废水在96h内不引起试验鱼的死亡时,可以认为毒性不显著。
鱼类毒性试验的半致死浓度LC50是反映毒物或工业废水对鱼类生存影响的重要指标。LC50的计算常用直线内插法,即在半对数方格纸上,以对数坐标轴表示浓度,以算术坐标轴表示死亡率,然后将试验数据一一标在方格纸上选取最接近于半数死亡率的两点,即大于50%死亡率的一点和小于50%死亡率的一点,用直线连接。直线与50%死亡直线相交,再从交点引一垂线至浓度坐标轴,即为LC50。
此法简单快速,但无法求出95%可信限。
表所列数据为假定的试验资料,根据表中试验结果,得出24h的LC50为5.2%,48h的LC50为4.7%和96h的LC50为4.4%。
③鱼类毒性试验结果的应用。鱼类毒性试验的一个重要目的是根据试验数据估算毒物的安全浓度,估算安全浓度的经验公式有如下几种:
目前应用比较普遍的是最后一种。对那些易分解、积累少的化学物质一般选用0.050.1之间的系数,而对于稳定的又能在鱼体内高蓄积的化学物质,系数都在0.01~0.05范围内选择。
一应用LC50值推导出安全浓度后,最好再进一步进行验证试验,特别是具有挥发性和不稳定性的毒物或废水,应当用恒流装置进行长时间的验证试验,96h内不发生死亡或中毒的浓度往往不能代表鱼类长期生活在被污染水体的安全或无毒浓度。
验证试验一般用10条鱼以上,在较大容器中用预想安全浓度进行一个月或几个月的试验,并设对照组进行比较。如有中毒症状发生则降低浓度再试验,直到确证某浓度对鱼是安全的,即可定为安全浓度。此外,验证试验过程中必须投喂饵料。
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