(1)选择 SPE 小柱或滤膜

首先应根据待测物的理化性质和样品基质,选择对待测物有较强保留能力的固定相。若待测物带负电荷,可用阴离子交换填料,反之则用阳离子交换填料。若为中性待测物,可用反相填料萃取。SPE 小柱或滤膜的大小与规格应视样品中待测物的浓度大小而定。对于浓度较低的体内样品,一般应选用尽量少的固定相填料萃取较大体积的样品。

(2)活化

萃取前先用充满小柱的溶剂冲洗小柱或用 5～10mL 溶剂冲洗滤膜。一般可先用甲醇等水溶性有机溶剂冲洗填料,因为甲醇能润湿吸附剂表面,并渗透到非极性的硅胶键合相中,使硅胶更容易被水润湿,之后再加入水或缓冲液冲洗。加样前,应使 SPE 填料保持湿润,如果填料干燥会降低样品保留值;而各小柱的干燥程度不一,则会影响回收率的重现性。

(3)加样

①用0.1 mol/L 酸或碱调节,使 pH<3或 pH>9,离心取上层液萃取;

②用甲醇、乙腈等沉淀蛋白质后取上清液,以水或缓冲液稀释后萃取;

③用酸或无机盐沉淀蛋白质后取上清液,调节 pH 值后萃取;

④超声 15min 后加入水、缓冲液,取上清液萃取。尿液样品中的药物浓度较高,加样前先用水或缓冲液稀释,必要时可用酸、碱水解反应破坏药物与蛋白质的结合,然后萃取。流速应控制为2～4mL/min,流速快不利于待测物与固定相结合。

(4)清洗填料

反相 SPE 的清洗溶剂多为水或缓冲液,可在清洗液中加入少量有机溶剂、无机盐或调节 pH 值。加入小柱的清洗液应不超过一个小柱的容积,而 SPE 滤膜为5～10mL。

(5)洗脱待测物

应选用5～10mL 离子强度较弱但能洗下待测物的洗脱溶剂。若需较高灵敏度,则可先将洗脱液挥干后,再用流动相重组残留物后进样。体内样品洗脱后多含有水,可选用冷冻干燥法。保留能力较弱的 SPE 填料可用小体积、较弱的洗脱液洗下待测物,再用极性较强的 HPLC 分析柱如 C18 柱分析洗脱物。若待测物可电离,可调节 pH 值,抑制样品离子化,以增强待测物在反相 SPE 填料中的保留,洗脱时调节pH值使其离子化并用较弱的溶剂洗脱,收集洗脱液后再调节 pH 值使其在 HPLC 分析中达到最佳分离效果。在洗脱过程中应减慢流速,用两次小体积洗脱代替一次大体积洗脱,回收率更高。