A)涂布未转化的感受态细胞。

如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落。

B)转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率。

例如,将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后,用100ul铺板。培养过夜,产生1000个菌落。转化率为: 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA,用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA,用1/10铺板,共用1 ng DNA。转化率为:

1000克隆X10(3次方) ng /铺板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ ug

转化pGEM-T应用10(8次方)cfu/ ug感受态细胞

如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低。

C)如用pGEM-T正对照,或PCR产物,产生>20-40蓝斑(用指定步骤10(8次方)cfu/ ug感受态细胞),表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶(M1801,M1804,M1794)质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。

D)用pGEM-T或pGEM-T Easy载体,连接pGEM-T正对照,转化高频率感受态细胞(10(8次方)cfu/ug),按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60%应为白斑,如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落,连接有问题。