聚合酶链反应（PCR） 技术--引物的设计以及初步筛选

①引物的长度一般为15-30 bp,最好在18~24 bp,因为太短易形成错配(False priming) 降低特异性,而太长也会降低特异性,并且降低产量 。

②引物在模板内最好具有单一性,也就是说在模板内部没有错配。特别是3’端,一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。

③引物序列的GC 含量最好在40%一60%,且上下游引物序列GC含量的差异不要太大,3’端最后5个碱基最好不要富含GC,特别是连续3个的G或C。

④DNA双链形成所需的自由能AG,应该以5’端向 3’端递减,3’端AG最好不要高于9.0 keaf mol 。

⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairpin),AG高于4.5 keal/mol时易引发 上述两种结构的产生。

⑥ 引物所在的模板区域应该位于外显子区,最好跨越一个内含子区,这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

⑦ 如果以DNA为模板设计引物,产物长度在100—600 bp比较理想。而以mRNA为模板设计引物时,产物长度在150—300 bp比较理想。

⑧5’ 端对PCR影响不太大,可以引进修饰位点和标记物 。