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数字PCR缘何是PCR的未来?群雄逐鹿,几分天下?

2022.1.12
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我爱秋天

君子有九思

  新冠疫情之下,“测核酸”已成为全民热词,PCR作为测核酸的官宣仪器也火爆热卖,这里指的是荧光定量PCR(qPCR)。大家知道,有时的“漏检”是因为病毒的copy数太低;而若想减少甚至消除“漏检”,可用另一种更灵敏更精准的数字PCR(digital PCR,dPCR)技术。dPCR和qPCR到底有何区别?为什么说dPCR的效果更好?它能解决哪些问题?国内外有哪些dPCR的玩家?本文将揭秘dPCR的前世今生,并对市场上dPCR的代表性产品逐一展示,希望能为您下次入囊前做点儿准备。

PCR定量发展简史

  PCR即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),它以DNA双链复制原理为基础,对特定核酸样本进行体外扩增,能够将微量的核酸样本迅速拷贝至几百万倍。自1985年美国科学家Kary Mullis发明PCR以来的三十多年,PCR经历了三代技术的发展。第一代传统PCR技术,采用琼脂糖凝胶电泳的方法对PCR产物进行定性分析;第二代荧光定量PCR(qPCR)技术,通过在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控PCR进程,最后用进入扩增指数期时的Cq值(罗氏)或Ct值(AB/赛默飞)对基因进行定量分析。

  为何第一代PCR只能定性?这是因为PCR反应事实上呈现S型,在反应终点区测定终点产物的数量误差很大,因此只能定性。第二代qPCR利用拐点产物数量定量,重现性好,当结合标准曲线后,可以实现绝对定量。这同分析化学上讲的定量方法并无区别,实现定量,需要找到标准样品,需要做标准曲线。

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  图1 利用拐点产物数量进行定量的实时荧光定量PCR

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  图2 实时荧光定量PCR实现绝对定量

  下面我们重点说说神奇的第三代数字PCR(dPCR)技术,这种定量技术,既不需要标准品,也不需要做标准曲线,即可实现对起始样本的绝对定量,灵敏度和准确度还特别高。纵观当今分析技术,唯有dPCR可以实现不需标准曲线的绝对定量,足可笑傲定量江湖,用降维打击、一举封神、YYDS等各种赞誉来形容它都挺合适。

  dPCR的基本原理是:通过将PCR反应液进行有限稀释,实现核酸分子的单分子扩增,最终采取终点法检测阳性微滴的荧光信号,有荧光信号的微滴判读为 1;没有荧光信号的微滴判读为 0,因此该技术被称为数字PCR。简而言之,就是把复杂的定量工作简化成“1”和“0”,没有寻找标准品的困扰,没有做标准曲线的烦恼,把所有人为误差统统丢掉,这就是dPCR被誉为PCR技术之未来的底气。

  数字PCR的诞生

  1992年,Sykes等在检测复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因时,利用样品的有限稀释,让每个微孔只获得单个模板分子,通过计算PCR后的扩增信号,以期准确确定原始分子的数量,虽然没有明确提出“数字PCR”的概念,但是已经建立了数字PCR基本的实验流程,并且确定了数字PCR检测中一个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”作为定量方法,这是数字PCR的雏形。1999年,霍普金斯大学的Bert Vogelstein和他的同事Kenneth Kinzler等在分析癌症突变的罕见基因型过程时,因受到体细胞基因的干扰,而遇到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈,采用了在384孔板中对每个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式,从而明确提出了数字式PCR的概念,同时也提出如果采用更多孔板其检测灵敏度会更高,从而指出了dPCR系统的发展方向。

  dPCR是PCR技术上里程碑式的飞跃,其概念被提出后,受限于当时的技术条件,如样本稀释及分配都是靠手工来完成的,干扰和限制因素较多;并且结果分析对于研究者来说也十分枯燥与繁琐,因此在很长一段时间dPCR发展停滞不前。后来由于微流控技术与微纳集成制造工艺的发展解决了dPCR应用过程中的几个关键技术问题,推动了dPCR的研究与商业化的发展。

  细说dPCR原理

  数字PCR的基本原理是:将稀释的核酸样品分配到大量独立的微反应单元,进行大规模单拷贝PCR扩增反应和基于泊松分布(Poisson distribution)的绝对定量分析。与RT-qPCR不同,dPCR不需要使用标准曲线,即可实现目的核酸拷贝数的绝对定量。dPCR平台是基因和细胞治疗的标配,在载体开发中可以用作质量控制检测。

  目前根据dPCR样本稀释分配的方式,基本可分为三大类,一种是基于大规模集成的微流控芯片;第二种是使用微反应室/孔板;第三种是基于液滴式。其中后者是近年来dPCR分析仪的主流。液滴数字PCR(ddPCR)是一种基于水油乳液液滴技术的dPCR方法,其将样品分馏成20,000个液滴,并在每个液滴中发生模板分子的PCR扩增。ddPCR 技术使用的试剂和工作流程与大多数基于TaqMan探针的标准检测有着相似的试剂和工作流程。大规模样本分区是dPCR 技术的一个关键方面,不论是芯片式还是液滴式,其基本原理都是将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或者液滴当中,每个反应器的核酸模板数少于1或者等于1。经过PCR扩增之后,有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积,可以推算出原始溶液的核酸浓度。

  

图3 液滴dPCR检测原理

  数字PCR的主要技术特点

  dPCR具有灵敏度高(可达0.001-0.0001%),特异性强,可检测复杂背景下的靶标序列;可高度耐受PCR反应抑制剂,如SDS(十二烷基磺酸钠)、EDTA(乙二胺四乙酸)、Heparin(肝素,血液抗凝剂)等;不必依赖对照品或标准品,可对目标拷贝数直接进行精确定量,分析微小的浓度差异;实验数据分析便捷,每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读,数据分析自动化;可统计突变率,通过统计分析可得出靶点的突变率。

  作为近年来兴起的分子诊断分析技术,dPCR在应用技术上还存在需要改进的地方,如通量较低,一般单个反应2重反应效果最佳;dPCR优点是灵敏度高,但是对于DNA浓度大的样本来说优势就不能体现,而且核酸浓度高时,每个微滴里面包含的拷贝数不符合泊松分布;dPCR虽然不依赖标准曲线,但是每次反应之间存在差异,短期内不能完全取代qPCR,也不能代替其他金标准方法。

数字PCR仪在细分领域的应用前景

  dPCR技术的出现不是为了完全取代原有分子诊断技术,而是更好的补充和完善现有技术平台。dPCR为不同应用场景下的多样化核酸检测需求提供了新的思路,尤其是在医学检验方面,在感染性疾病早期检测、癌症的液体活检、无创产前检查等领域展现出良好的应用前景。

  dPCR的优势与临床应用前景已在许多研究中得到确认,但最终实现在临床上的广泛应用,需要以下几个方面进行升级:商用dPCR系统需要进一步提升样本检测通量以充分满足病毒筛查的需求;需要制定国家或行业统一标准。目前新羿生物已经推动了dPCR的地方标准(DB 32/T3762.16-2001 新型冠状病毒检测技术规范第16法:核酸数字PCR),用于新冠病毒检测;需要产业界进一步降低设备成本;基于dPCR的新冠检测试剂盒需要经过严格评价,并获得NMPA、FDA、CE等监管机构的认证才可投放国内或海外市场。

  实现感染性疾病早期高效检测——以新冠病毒为例

  (1)病毒检测。qPCR检测技术是目前新冠病毒检测的“金标准”,但由于病毒探针结合位点突变、样本病毒载量不足等原因,在临床检测过程中经常出现假阴性结果,由于dPCR具有更高的灵敏度、精准度,以及其适合痕量样本检测的特性,能够纠正RT-qPCR检测出的“假阴性”结果,作为后者的补充方法。

  (2)临床样本病毒载量评估。在人群筛查及临床诊疗中,为科学选取采样方式,需要评估不同临床样本病毒载量,如鼻咽拭子、血尿、粪便、肺泡灌洗液等,由于dPCR可提供绝对量化指标,为采样方法的选取提供了参考,从而提高检出率。

  (3)监测环境病毒载量。在外防输入的战略要求下,环境病毒检测尤为重要。dPCR可对低核酸丰度样本进行有效检测,包括从不同环境中取样的样本,如病房、卫生间、实验室等等,在疫情防控中起到了不可忽视的作用。此外,dPCR的应用场景还有病程不同阶段的病毒载量评估、核酸参考品制备、抗病毒药物研发等环节。

  助力癌症液体活检——实现患者全病程监控

  液体活检是普通癌症检测的延伸和补充方法,将目标采取样本从组织延伸到血液、体液。dPCR可精确检测转移到血液循环中的肿瘤细胞和DNA片段,提供基因突变情况等信息,动态监控病人病程的发展,从而为伴随诊断和个性化治疗提供可靠依据。

  高效筛查胎儿疾病——提高无创产检普及性和依从性

  通过无创产前检查,针对胎儿染色体非整倍体异常、遗传性基因疾病等进行风险评估。目前,大多数商品化的无创产前检查产品都是基于二代测序的技术和平台,该方法检测周期长(1-2周出报告)、技术门槛高、检测费用高,阻碍了该技术的广泛应用。而基于dPCR的无创产前检测技术有望实现准确、快速、简便的产前筛查。

数字PCR的市场分布及预测

  全球市场分布和预测

  目前数字PCR市场规模并不大,全球约1.5亿至2.5亿美元,占实时定量荧光PCR市场总规模(约20亿美元)的10%,但增长趋势显著,有望在技术成熟后与目前的qPCR平分江山,甚至逐步替代qPCR技术。

  研究报告预测,2019-2024年全球qPCR和dPCR市场将以8.8%的年复合增长率增长,从2014年的41.13亿美元增长到2024年的62.7亿美元。其中,dPCR的增速更快达11.9%,将从2014年的4.75亿美元,增长到2024年8.34亿美元;qPCR的年增速为8.37%,从2014年的36.28亿美元,增长到2024年的54.37亿美元。这个预测没有料及2020年新冠疫情的爆发,为PCR检测带来极大的市场。但图4的发展趋势还有参考价值。

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图4 2017年-2024年dPCR全球增长情况预测

  从市场的角度来看,北美依然是dPCR最大的主导市场,其次是亚洲和欧洲。北美市场增长是由于北美地区存在慢性病的高患病率和完善的医疗保健基础设施等。此外,有利的政府举措和研究伙伴关系数量的增加,是预计市场增长的驱动因素。

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图5 dPCR全球市场分布

  把企业类型分为三档,其中第一档为收入大于10亿美元企业。第二档为1亿至10亿美元,第三档为小于1亿美元,分别占有45%,34%,21%,这说明该行业存在巨头,但是尚未形成垄断,对于相对其他企业仍有机会。dPCR由几个主要公司占据一半的全球市场,包括Bio-Rad Laboratories Inc.,Thermo Fisher Scientific,Fluidigm Corporation,QIAGEN,Sysmex Corporation,JN Medsys,Merck KGaA,Stilla和Avance Biosciences等。

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图6 液滴dPCR在癌症细分市场的应用

  ddPCR是近年来PCR的主流技术,推动细分市场增长的因素是癌症,传染病的患病率增加以及检测中心资金的增加。

  中国市场分布和预测

  在精准医疗、个性化用药等需求推动下,分子诊断技术在全球得到飞速发展。我国dPCR行业一直保持着稳定快速的增长。根据沙利文(Suvillian)数据显示,中国dPCR行业市场规模从2013年的14.6亿元增加至2017年的72亿元,年复合增长率CAGR=29.2%,到2022年市场规模预计将达到266.6亿元人民币。

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  图7 数字PCR市场规模预测(亿元)

  (资料来源:Frost&Suvillian,国元证券研究中心)

  国内dPCR行业市场规模持续快速增长,主要受到精准诊断需求增加、技术突破增加利润、国家政策支持(国产替代)等因素影响,未来dPCR将会有更大的发展空间,这是因为(1)人口增长与老龄化:我国人口老龄化趋势导致肿瘤医药市场增长和体外检测需求增长,而dPCR在肿瘤检测、传染病检测、遗传病等疾病检测上优势明显,医疗市场的扩容将进一步推动dPCR的增长;(2)国内政策利好:根据国家科技部办公厅发布的《“十三五”医疗器械科技创新专项规划》,要求重点开发POCT检测、新型基因测序仪、随检全自动核酸检测系统、定量dPCR等系统;(3)精准医疗与肿瘤治疗需求:精准医疗的基础在于个体化医疗,对致病突变检测和定量分析的精确性要求较高,亟需新一代PCR技术的应用,而数字PCR在这方面优势明显。

数字PCR的主要产品

  自2006年,Fluidigm公司推出第一个商业化的基于芯片的dPCR仪以来,数字PCR仪不断实现创新和突破。在稀释方式上,主要的是伯乐为代表的液滴式、以Fluidigm、赛默飞为代表的芯片式和罗氏、凯杰为代表的微板式。国外dPCR主要是三个模块组成的一体机,而国内大多还是几台仪器分别完成样本分区、扩增和数据读取。新冠疫情下,dPCR生产商无不在产品上实现突破,近年来新品频出,直有问鼎分子诊断之势。

  Bio-Rad(伯乐)

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图8 伯乐QX ONE ddPCR系统

  拥有二十多年PCR仪研发、生产经验的伯乐公司是全球dPCR市场的领跑者。伯乐于2011年斥资1.62亿美元,完成对QuantaLife公司的收购,正式进军dPCR市场,随即推出QX100、QX200微滴式数字PCR系统以及最新的QX One集成液滴数字系统。2017年,伯乐又收购了ddPCR系统制造商RainDance Technologies,该公司拥有在短时间内生成数百万个皮升级微液滴的核心技术,可将伯乐原液滴数提升250-500倍。两者的融合进一步稳固了伯乐在dPCR领域的领军地位。

  根据2019年财报,伯乐销售额收入超23亿美元,ddPCR增长强劲。2020年,Bio-Rad发布了全球首款数字PCR一体机:Bio-Rad的 QX ONE ddPCR系统,整合了微滴生成、热循环反应及微滴读取等步骤,最大程度减少人工操作,提高了检测通量。配备四个独立的荧光通道,结合ddPCR特有的高阶多重PCR技术,可以在单反应孔中实现8重拷贝数变异(CNV)检测、5重突变检测或4重基因表达检测。兼容目前QX200 系统中所使用的supermix、assay和kit。

  美国FDA近来批准了Bio-Rad实验室开发的基于ddPCR技术的SARS-CoV-2检测的紧急使用授权。

  Thermo Fisher Scientific(赛默飞)

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图9 赛默飞QuantStudio™ Absolute Q™ dPCR 系统

  2021年11月,赛默飞推出了基于微流体阵列式芯片技术的Applied Biosystems™ QuantStudio™ Absolute Q™ dPCR 系统,该系统可在20480个固定纳米级微孔中生成95%以上的有效反应液滴,具有更少的死体积,且ROX通道具有质控功能,非正常液滴予以排除分析;PCR扩增前后信号采集,自动排除假阳性。配备3个LED光源,最多支持5个荧光检测通道,每份样本中可同时进行多靶标检测。

  Roche(罗氏)

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图10 Digital LightCycler数字PCR系统

  2021年11月,罗氏发布了基于Digital LightCycler System,在实验流程上具备高自动化的硬件设计,拥有6色荧光检测通道以及1通道的参比通道,针对通用检测、高灵敏度及高分辨率三种不同的应用需求提供不同的纳米孔板选择,可将多至96个样本的实验速度提高至常规数字PCR的2倍。

  此外,该系统可通过实验室信息系统(LIS)对样本进行信息自动化溯源,具有操作简便、通量高、速度快、通道全等性能和优势。

  Fluidigm(富鲁达)

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图11 BiomarkTM HD PCR系统

  BiomarkTM HD作为一款高性能的PCR系统,利用微流控技术构建纳升级反应体系,具有通量灵活、高度自动化的特点,整合了基因分型、基因表达谱、实时定量、数字PCR和单细胞基因表达谱分析等应用的多功能平台。

  基于高度集成的IFC微流控芯片,Biomark™ HD系统在短短几个小时内即可获得近万个数据点,具有显著的成本和时间优势。此外,该系统兼容多种不同规格的微流控芯片,在单一系统实现从中到高通量的实验需求。Biomark™ HD系统能给研究人员提供高通量和灵敏度低至单细胞水平研究的微流控芯片实时荧光定量PCR系统;该系统的优势在于实时荧光定量和终点PCR两种检测模式最大化该平台的灵活性;平台开放,能与实验时现行的Assay兼容,增加实验灵活性;强大的、用户友好的Biomark分析软件使高通量SNP基因分型,基因表达定量和数字PCR数据分析更精简实用。

  Stilla Technologies

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图12 六通道数字PCR仪

  成立于2013年的法国Stilla Technologies公司,早在2016年首次将三色目标多重检测引入数字PCR。2020年又推出了六通道数字PCR仪,提升了Naica™数字PCR系统的多重检测能力。Naica系统是一种高度灵敏的数字PCR解决方案,可在Crystal™ 数字PCR系统上运行。它最初具有三通道检测能力,如今具有六通道检测能力,可鉴定多种类型的核酸,已成为精准医疗、伴随诊断和疾病监控的理想工具。该系统简单易用,可在不到三小时内快速生成结果。

  QIAGEN(凯杰)

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图13 凯杰QIAcuity系列数字PCR系统

  QIAcuity系列数字PCR集样品分区、PCR扩增、信号检测于一体。QIAGEN全新基于纳米微孔板的一体化集成数字PCR系统,QIAcuity适用于对靶DNA或RNA分子进行绝对定量分析,兼容基于EvaGreen染料法或探针法的检测。QIAcuity采用独特技术,使实验流程简化至如同qPCR实验一般简单快速。QIAcuity基于纳米微孔板技术,将数字PCR的样本液滴制备、扩增和数据分析集成到全自动仪器中,在2小时内实现从样本到数据解读全过程。QIAcuity创新性纳米微孔板采用微流体技术,配置好PCR反应体系后,仪器自动将样品压入微孔板的纳米微孔中并对每个小孔独立密封。纳米微孔板技术可以做到物理分隔,保证分配到每个纳米微孔中的液滴大小均一,无液滴破裂融合或交叉污染。

  领航基因

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图14 全自动液滴数字PCR系统AD16

  领航基因推出的全自动液滴数字PCR系统AD16,整合液滴生成、PCR扩增、多通道荧光检测于一体,可自动实现样本的微滴化处理,快速进行PCR扩增和检测分析。AD16系统采用微流控芯片和油相表面活性剂,通过芯片上样提取的核酸后,即可实现无人值守:完全实现从“芯片进,结果出”的全自动化流程。大大简化了实验操作步骤,缩短了实验时间,全程仅约2小时。全自动液滴数字PCR系统提供对靶DNA或RNA分子进行绝对定量的一种方法,系统样本制备仪和生物芯片阅读仪实现与PCR扩增模块无缝整合,使得数字PCR系统应用更广泛。自动化系统减少了手工操作误差、使样本更稳定,后期检测更准确,同时节约了时间和成本。领航基因已经有多项数字PCR相关产品获得药监局批文。

  永诺生物

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图15 MicroDrop-20全新微滴式数字PCR

  永诺生物-MicroDrop-20全新微滴式数字PCR采用全封闭防污染设计,一键式自动化操作。微滴生成采用油包水乳化微滴技术,在微管道中利用气压驱动,2mins生成数万个微滴,高效高产。微滴生成芯片为高精度微流控芯片设计,三维微纳防污染结构,一张芯片可同时处理8个样本。微滴检测使用双通道荧光,支持EvaGreen染料法及探针法。检测通量高,可一次检测高达96个样本,支持灵活设定。

  臻准生物

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图16 AccuONE-200 数字PCR系统

  AccuONE系统由上样、扩增和分析三大功能模块组成,核心技术涉及微纳加工、精密仪器、生物试剂、图像识别与算法等;不同规格芯片微孔数可达2万、3万或5万,甚至更高;荧光通道数最多可达6个;系统操作简单,自动化程度高。经过大量实验表明,AccuONE系统的精确度和灵敏度等关键指标均已达到国外主流产品同等水平。上样系统小巧精致,可实现自动化精确上样,减少了人工操作。一键启动,快捷简便。通量的提高大幅提升了单日的检测极限,在大样本量的检测需求下,用户也可以从容应对。6色荧光通道配置实现了多重PCR检测,节约了宝贵的实验样本。AccuApp软件系统简单直观,界面洁简友好,极大降低了用户的上手难度。强大的AI算法加持,配合精确的图像识别和数据统计,最终呈现给用户清晰的图像和准确的实验数据。系统具有强大的兼容性和开放性,支持多种规格耗材,适配多种反应体系,开放的MIX试剂帮助客户快速高效地开发自己的应用产品。

  小海龟科技

  

图17 BioDigital青/青Pro数字PCR系统

  BioDigital青/青Pro数字PCR系统无需人工加样,真正实现了全自动液滴制备。系统包括液滴制备仪 Loader S200、芯片扩增仪 Cycler S200和生物芯片阅读仪 Imager S200,是完全自主知识产权的创新产品,单个样本支持开机,可并行处理最高96个样本,一次样本用量26µL,有效液滴数2万-20万,具有更高的检测范围和超高的检测灵敏度。系统标准设置4个荧光通道,可定制第5个荧光通道,在同类型数字PCR仪中处于领先地位。荧光通道数越多,单次反应可检测基因位点越多。特别在靶向药研究中,单次检测位点数增多,使得临床应用更灵活、广泛。

  BioDigital-青系列自动化程度高,可灵活组合,满足多样化及高通量需求。该系统可对荧光定量PCR或胶体金检测卡检测的灰区样本进行精准的判读。目前,小海龟科技已成功开发了40余种液体活检相关的检测试剂盒,BioDigital青系列数字PCR兼容第三方qPCR试剂盒,保证了试剂盒开发的高效性,预期未来3年内将在BioDigital系列数字PCR平台上完成100余种应用试剂盒的开发。

  新羿生物

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图18 新羿TD-2数字PCR平台

  近日,新羿生物5色微滴数字PCR生物芯片分析仪(TD-2)正式获得医疗器械批文(京械注准20212220583),是全球首款基于流式检测的5色微滴数字PCR分析仪获得临床准入。TD-2数字PCR的全封闭微滴PCR扩增和流式检测系统,多重防污染设计,荧光检测灵敏度高、信噪比好、多指标检测能力强、液滴数目不易受限制。

  TD-2数字PCR利用激光准共聚焦光路高效激发液滴荧光,在光谱带宽内完成更多荧光通道检测,专利算法消除通道间的荧光串扰,实现5色荧光通道同步高速检测。


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