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电泳分析常用方法--琼脂糖凝胶电泳法操作方法

2022.1.17
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zhaoqisun

致力于为分析测试行业奉献终身

  1.仪器装置

  电泳室及直流电源同纸电泳。

  2.试剂

  (1) 醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0)

  取冰醋酸 50ml,加水800ml混合后,用氢氧化锂调节pH**3.0,再加水**

  1000ml。

  (2) 甲苯胺蓝溶液

  取甲苯胺蓝 0.1g,加水100ml使溶解。

  3.操作法

  (1)制胶

  取琼脂糖约 0.2g,加水10ml,置水浴中加热使溶胀完全,加温热的醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0)10ml,混匀,趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上,厚度约 3mm,静置,待凝胶结成无气泡的均匀薄层,即得。 (2) 标准品溶液及供试品溶液的制备照各药品项下规定配制。

  (3) 点样与电泳

  在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上,经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样 1μl,立即接通电源,在电压梯度约 30V/cm,电流强度1~2mA/cm的条件下,电泳约20分钟,关闭电源。

  (4) 染色与脱色

  取下凝胶板,用甲苯胺蓝溶液染色,用水洗去多余的染色液**背景无色为止。

  四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法

  1.仪器装置

  通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极,铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。

  2.试剂

  (1)溶液 A

  取三羟甲基氨基甲烷 36.6g,四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml,再加水溶解并稀释** 100ml,置棕色瓶内,在冰箱中保存。

  (2)溶液 B

  取丙烯酰胺 30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g,加水溶解并稀释**100ml,滤过,置棕色瓶内,在冰箱中保存。

  (3)电极缓冲液(pH8.3)

  取三羟甲基氨基甲烷 6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释**1000ml,置冰箱中保存,用前稀释 10倍。

  (4)溴酚蓝指示液

  取溴酚蓝 0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90%乙醇5ml,微热使溶解,加 20%乙醇制成250ml。

  (5)染色液

  取 0.25%(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液** 10ml。

  (6)稀染色液

  取上述染色液 2ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液**10ml。

  (7)脱色液

  (2)标准品溶液及供试品溶液的制备

  照各药品项下的规定。

  (3)电泳

  将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内,每管加供试品或标准品溶液50~100μl,为防止扩散可加甘油或40%蔗糖溶液1~2滴及0.04%溴酚蓝指示液 1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04%溴酚蓝指示液数滴,玻璃管的上部用电极缓冲液充满,上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA,数分钟后,加大电流使每管为 2~3mA,当溴酚蓝指示液移**距玻璃管底部1cm处,关闭电源。

  (4)染色和脱色

  电泳完毕,用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入,胶条即从管内滑出,将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡 10~30分钟,以水漂洗干净,再用脱色液脱色**无蛋白区带凝胶的底色透明为止。

  (5)结果判断将胶条置灯下观察,根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。

  相对迁移率 供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率(R''<[m]>)进行比

  较。其计算式如下: 进胶端到供试品或标准品区带的距离 相对迁移率(R''<[m]>)=──进胶端到溴酚蓝区带的距离 扫描 将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分,由各组分的峰面积计算百分含量。7%醋酸溶液。

  3.操作法

  (1)制胶

  取溶液 A2ml,溶液B5.4ml,加尿素2.9g使溶解,再加水4ml,混匀,抽气赶去溶液中气泡, 加 0.56%过硫酸铵溶液2ml,混匀制成胶液,立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加**底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达 6~7cm, 然后徐徐滴加水少量,使覆盖胶面,管底气泡必须赶走,静置约 30分钟,待出现明显界面时即聚合完毕,吸去水层。


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