1.紫外-可见光检测器(UV-VIS)
紫外-可见光检测器是HPLC中应用最为广泛的检测器,其使用率占到70%左右,对占物质总数约80%的有紫外吸收的化合物均有响应,既可测190~350nm范围(紫外光区)的光吸收变化,也可向可见光范围350~700nm延伸。这种检测器灵敏度高,线性范围宽,对流速和温度变化不敏感,可用于梯度洗脱分离。紫外-可见光检测器要求被检测样品组分有紫外-可见光吸收,而使用的流动相无紫外吸收或紫外吸收波长与被测组分紫外吸收波长不同,在被测组分紫外-可见吸收波长处没有吸收。
操作使用紫外-可见光检测器的注意事项:
①因紫外光会损伤眼睛,不要直接观察点亮的紫外灯。
②对高压仪器部件等接触时要小心。
③某些光源会产生臭氧,对人有害。用惰性气体吹扫检测器是最常用的消除有害气体的办法,热催化也可以用来分解臭氧。
④检测池容易发生泄漏。紫外-可见光检测器的溶剂泄漏时,溶剂蒸气可能毁坏光学元件表面。
2.光电二极管阵列检测器(DAD)
普通的紫外-可见吸收检测器只能测定某一波长时吸光度与时间关系曲线,即只能作二维图谱。要测定某组分的紫外-可见吸收光图谱,需采用“停泵扫描”的方法,使被测组分停留在检测池中,然后用波长扫描测定。光电二极管阵列检测器(DAD)能够同时测定吸光度、时间、波长三者的关系,通过计算机处理,显示出三维图谱(图1),也可以作出任意波长下的吸光度-时间曲线(色谱图)和任意时间的吸光度-波长曲线(紫外可见光谱图)。
图1 DAD三维图谱
DAD与普通紫外-可见光检测器相比,光路安排上有明显区别。前者光源发出的光束先通过检测池被吸收后再被分光:后者光源发出的光束先被分光,然后选择一東特定波长的光束通过检测器。因此前者很难制成双光束检测器,检测稳定性较差;后者可把通过检测池前的单色光分成两束,一束通过检测池,另一束作为参考,实现双光束检测,检测稳定性大大提高。
二极管阵列检测器可以提供关于色谱分离、定性定量的丰富信息;也给出了一些特殊功能,如色谱峰的准确定性、峰纯度检验、峰抑制、宽谱带检测、选择最佳波长等。其主要特点包括:①可以同时得到多个波长下的色谱图,因此可以计算不同波长的相对吸收比。②可以在色谱分离期间对每个色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图,并计算其最大吸收波长。③在色谱运行期间可以逐点进行光谱扫描,得到以时间-波长-吸收值为坐标的三维图形(维色谱光谱图),可直观、形象地显示组分的分离情况及各组分的紫外-可见吸收光谱。由于每个组分都有全波段的光谱吸收图,因此可利用色谱保留值规律及光谱特征吸收曲线综合进行定性分析。④可以选择整个波长范围、几百纳米的宽谱带检测,仅需一次进样,将所有组分检测出来。
3.示差折光检测器(RID)
示差折光检测器也称光折射检测器,是一种通用型检测器。基于连续测定色谱柱流出物光折射率的变化来测定溶质浓度(图2),溶液的光折射率是溶剂(流动相)和溶质各自的折射率乘以其物质的量派度之和,溶有样品的流动相和单纯流动相光折射率之差即表示样品在流动相中的浓度。原则上凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用其检测,检测限可达10—6~10—7g/ml。
图2 示差折光检测器原理
RID作为一种通用型检测器,其优点是通用性强,结构简单,操作便利。然而其缺点也显而易见,由于折射率对温度的变化非常敏感,大多数溶剂折射率的温度系数约为5×104,因此检测器必须恒温,オ能获得精确的结果。即使是室温的变化也会影响基线的稳定性,大的溶剂前延峰可能会掩盖前期脱洗的色谱峰,洗脱液的组成一定要恒定,不能使用梯度洗脱检测池不能带压工作,在与其他检测器串联使用时应放在最后。
4.蒸发光散射检测器(ELSD)
蒸发光散射检測器是一种高灵敏度、通用型检测器,尤其对一些较难分析的样品,如磷脂、皂苷、生物碱、甾族化合物等无紫外吸收或紫外末端吸收的化合物更具有其他HPLC检测器无法比拟的优越性。
其主要特点包括:
①可以用来检测任何挥发性低于流动相的样品,包括氨基酸、脂肪酸、糖类、表面活性剂等
②对流动相的组成不敏感,可以用于梯度洗脱;
③对各种物质具有几乎相同的响应,浓度测定更加简单易行;
④检测灵敏度要高于低波长紫外检测器和示差折光检测器,检测限可低至10—10g;
⑤操作简便,可以与任何品牌的HPLC系统连接。
ELSD作为通用型检测器也存在着一些不足:①耗气量大(大约500 ml/min,相当于1钢瓶气体/24h);②对某些样品(如磷脂)检测器线性范围较窄,质量与峰面积有时不成线性关系,常需要通过计算机模拟来校正响应,较为复杂;③若样品溶质为挥发性的,将会与溶剂一同蒸发,导致无法检测或响应极弱,往往需要通过降低蒸发温度才能准确定量;④ELSD检测要求流动相及流动相中加入的改性剂必须有良好的挥发性,这样就使非挥发性的缓冲盐的应用受到了限制。
5.荧光检测器(FLD)
许多化合物,特别是芳香族化合物、生化物质,如有机胺、维生素、激素、酶等被入射的紫外光照射后,能吸收一定波长的光,使原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高电子能态的某些振动能级。之后,由于电子在分子中的碰撞,消耗一定的能量而下降到第一电子激发态的最低振动能级,再跃迁回到基态中的某些不同振动能级,同时发射出比原来所吸收的光频率较低、波长较长的光,即荧光。被这些物质吸收的光称为激发光,产生的荧光称为发射光。荧光的强度与入射光强度、量子效率、样品浓度成正比。荧光检测器光路系统如图3所示。
图3 荧光检测器光路系统
光源发出的光经半透镜分成两束后,分别通过吸收池和参比池,再经滤光片照射到光电倍增管上,变成可测量的信号。参比池有助于消除外界的影响和流动相所发射的本底荧光。一般采用氙灯作光源,以便获得宽波长范围(250~600m)的连续光谱。若在半透镜前置单色器分光,测量池后也采用单色器选择测定波长,这种结构即为荧光分光检测器。
某些物质虽然本身不发光,但含有适当的官能团可与荧光剂发生衍生化反应,生成荧光衍生物,它们也可用荧光检测。衍生化方法有两种:其一为柱前衍生化,此法较简单,但定量重复性较差;其二为柱后衍生化,此法重复性好,但会造成谱峰的扩展。在氨基酸和肽的分析中,经常采用荧光胺作为衍生化试剂,邻苯二甲醛、丹酰氯也是常用的行生化试剂。
FLD的最大优点是极高的灵敏度和良好的选择性,其灵敏度比紫外-可见检测器高约两个数量级,最小检测量可达10—13g,适合于痕量分析。线性范围较宽,约为104~105,可用于梯度洗脱,受外界条件的影响较小,而且它所需要的试样很小,因此在药物和生化分析中有着广泛的用途。但是它只能检测有荧光基团和衍生化之后有荧光基团的化合物,这就限制了其应用,而且对通常发生在荧光测量中的一些干扰非常敏感,如背景荧光和猝灭效应等。
6.电导检测器(CD)
电导检测器是离子色谱中使用最广泛的检测器,其作用原理是用两个对电极测量水溶液中离子型溶质的电导,由电导的变化测定淋洗液中溶质浓度。这种检测器的死体积小,如采用抑制电导法,其灵敏度可达10—8g/ml,线性动态范围为103。
电导检测器是一种通用型电化学检测器,具有结构简单、操作成本低及死体积小等特点。电导检测器测量的是溶液的电导或电阻,因此,主要用于检测以水溶液为流动相的离子型溶质。当流动相的离子浓度恒定时,由于电导检测器对流速和压力的变化不敏感,可用于梯度洗脱的测量。温度对电导检测器的影响较大,每升高1℃,电导率增加2%~2.5%,借助热敏电阻监控器和电子补偿电路可以消除温度的影响,一般情况下电导检测器都应置于绝热恒温设备中。
7.安培检测器
安培检测器是电化学检测器中应用最广泛的一种检测器。安培检测器要求在电解池内有电解反应的发生,即在外加电压的作用下,利用待测物质在电极表面上发生氧化还原反应引起电流的变化而进行测定的一种方法。
工作电极一般是以碳糊、石墨或玻碳为基质,表面经过严格抛光制成。碳糊电极在制备时要按一定比例掺入精制液体石蜡、润滑剂、矿物油或硅油等。参比电极一般为 Ag/AgCl电极,辅助电极是用金或铂金制成的。一般在工作电极和参比电极之间施加一恒定的电位,经过色谱分离后的溶质通过一个很小体积的薄层池,当所加的电位比要分析溶质的氧化电位更正时(若使用还原剂则所加的电位要比分析溶质的还原电位更负),溶质就会在电极和溶液之间发生氧化(或还原)反应,这样在溶液和电极之间就会产生电子转移,从而形成电流。将这种很微弱的电流接收、放大并记录下来,就可得到色谱图。
安培检测器采用固体工作电极,电极可用于较高的正电位,故能检测氧化性物质,适用范围很宽,一般是4~5个数量级,有的可达6个数量级。安培检测器结构简单,池体积小,响应快,噪声低,灵敏度高,最小检测限可达10—9~10—12,选择性高。但是安培检测器所使用的流动相必须具有导电性,对流动相的流速、温度、pH值等因素的变化比较敏感,在测量还原电流时,流动相中痕量的氧也可能发生电解反应,引起干扰。此外,由于电极表面不能更新,容易污染,需要经常清洗或更换。
8.化学反应检测器
HPLC的发展要求通用型的高灵敏度检测器。前面介绍的HPLC常用检测器中灵敏度高者都是选择型检测器,要求被测物质具有某些特定的性质。通用型的检测器如示差折光和蒸发光散射的灵敏度皆不高,达不到分析微量以及痕量成分的目的。化学反应检测器就是将被测物质进行某种化学反应(衍生反应、酶反应等)后再用高灵敏度的某种检测器进行检测。氨基酸分析仪是其典型应用。将无色的氨基酸通过色谱柱分离后与衍生化试剂茚三酮反应,生成在570nm处有强吸收的有色化合物,然后用紫外-可见光吸收检测器检测。
化学反应检测器的最初阶段多采用液液化学反应,这种反应方式会引起本底增高,并由于柱外效应引起谱带展宽,限制了化学反应检测器的使用。近年来开始探索液固化学反应在化学反应检测器中的应用,发展了固相化学反应检测器。这大大减小了柱外效应,过量的反应试剂和催化剂也不会进入检测器,减小了本底和对谱带展宽的影响,使化学检測器得到较快的发展。特别是近年来生物医学使用了固定化酶反应器,大大提高了HPLC化学反应检测器的检测能力。
9.其他检测器
在 HPLC中除上述常用检测器外,还有一些检测器可供选择使用。
(1)介电常数检测器一种通用型检测器,灵敏度低,通用性强。工作原理:随流动相中流出组分的改变,其介电常数、电容量也改变,因此测定流动相的电容量变化,即可检测组分的变化。介电常数检测器性能类似于示差折光检测器,但其应用不如前者普遍。
(2)电位测定检测器利用离子选择电极测定流出液的电位,流出液组成改变,电位也发生变化。使用不同的离子选择电极(如卤离子电极、银离子电极等)可测定不同的离子浓度变化情况。
(3)放射性检测器,一种检测流动相中有放射性标记组分的特殊检测器。其响应范围很宽,对没有放射性的流动相成分的改变不敏感,可有效地使用梯度洗脱技术。
(4)光电导检测器是利用某些化合物受强烈紫外光照射引起光电离形成离子的现象,在电导池中检测。这种检测器对鹵代物和许多含硫和氮的光敏化合物有选择性响应。光电导检测器对某些化合物的灵敏度比紫外-可见光吸收检测器还高,可达10g,两者线性范围相似。
(5)红外检测器红外吸收可用作HPLC的选择性检测。这种方法主要用于凝胶色谱,且只能用于流动相对所用红外波长没有吸收的体系。这里所说的红外检测器与HPLC-FTIR联机时FTIR作为检测器不同,后者由于快速扫描和快速傅里叶变换,不用停流就可以得到每一个色谱峰的红外光谱图。
(6)手性检测器常用的手性检测器包括激光旋光检测器和圆二色检测器。主要用于对药物等具有光学对映异构体的分离分析。旋光检测器是基于旋光活性化合物折射率的差异进行分离,对旋光化合物而言是一种通用型检测器;圆二色检測器是基于圆二色性(由于包含发色团的分子的不对称性而引起左右两圆偏振光具有不同的光吸收的现象)制造的检测器,其较旋光检测器具有更高的选择性。二者都是中等灵敏度的检测器,对温度和泵的脉动、溶解气体等造成的压力改变而导致的流动相折射率变化非常敏感。
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