液相色谱仪液体样品预处理技术--固体、半固体样品预处理

样品必须制成液态才能进行HPLC分析。有些不溶固体中含有可溶性被测物,比如固体合物中的添加剂、食品中的脂肪、土壤中的多环芳烃。使样品与溶剂相接触,被测物被萃取出,随后经倾倒、滤过或离心将溶剂从固体残渣中分出。如必要,进一步处理滤液,再进 HPLC分析。

一、传统萃取方法

1.溶解

溶解方法就是采用强溶剂直接溶解固体、半固体样品,使被测物溶入溶液,其中会发生不发生化学变化。无机固体可能需加酸或碱达到完全溶解;有机样品往往能直接溶于溶剂中;溶解后,可能需要滤过。 

2. 固-液萃取

固-液萃取就是将样品置于容器内,加入溶剂溶解有关被测物,从固体中滤出溶液(有时称“振摇/过滤”法)。有时可煮沸或回馏溶剂以提高溶解度;细小分散状态的样品易于浸出;样品可用人工或自动振摇;经滤过、倾析或离心从不溶性固体中分离出样品。

3.索氏提取

样品置于活动的多孔容器(套管)中;回馏溶剂不断流过该套管,溶解被测物,连续收到蒸馏瓶中,以纯溶剂提取;样品在溶剂的沸点处必须稳定;缓慢,但提取直至完成不需有人照看;价低;对自由流动粉末最好;回收率很好。

4.超声提取

将细小的分散样品浸没于装有溶剂的超声容器中,进行超声辐射。也可用超声探头或杯型超声破碎器。用超声作用辅助溶解;可加热提高萃取速率安全、快速;最适于粗糙、颗程状物质;可同时处理多份样品;与溶剂的接触效率高。

5.均一化

样品置混合器中,加入溶剂,使样品均一化成细小离散状态;除去溶剂,进一步混匀。用于动植物组织、食品、环保样品;可用有机与水溶剂;可加冰或硅藻土使样品流动性增大;对小分散样品的萃取效率高。

6.强制流动浸出

样品置于流通管中,并使溶剂从中流过。加热流通管至溶剂的沸点附近。适于颗粒性样品;溶剂能用高压N₂注入或推过;溶剂体积小于索氏提取;结果相似,速度更快。

二、新型萃取方法

1.超临界流体萃取

超临界流体萃取(SCFE)技术作为一项应用广泛的实用性技术,近些年来发展迅速。作为溶剂的超临界流体与被萃取物料接触,使物料中的某些组分(称萃取物)被超临界流体解并携带,从而与物料中其他组分(萃余物)分离,之后通过降低压力或调节温度的方法纸超临界流体的密度,从而降低其溶解能力,使超临界流体解析出其所携带的萃取物,达到萃取分离的目的。

当流体的温度和压力处于它的临界温度和临界压力以上时,即使继续加压,也不会液化,只是密度增加而已,它既具有类似液体的某些性质,又保留了气体的某些性能,这种状态的流体称为超临界流体。超临界流体萃取技术就是利用超临界流体在超临界状态下溶解分离的液体或固体混合物而使萃取物从混合物中分离出来。超临界流体具有若干特殊的性质,超临界流体的密度比气体大数百倍,与液体的密度接近。其黏度则比液体小得多,仍接近气体的黏度。超临界流体既具有液体对物质的高溶解度的特性,又具有气体易于扩散和流动的特性。对萃取和分离更有用的是,在临界点附近温度和压力的微小变化会引起超临界流体密度的显著变化,从而使超临界流体溶解物质的能力发生显著的变化。因此,通过调节温度和压力,人们就可以有选择地将样品中的物质萃取出来。CO₂仅临界密度(0.448g/cm³)大、临界温度(31.06℃)低、临界压力(7.39MPa)适中,而且便宜易得、无毒、化学惰性、易与产物分离,因此是目前最常用、最有效的超临界流体。

与一般液体萃取技术相比,SCFE技术的萃取速率和范围更为理想。萃取过程是通过调节温度和压力来控制与溶质的亲和性而实现分离的。其特点是:

①通过调节P可提取纯度较高的有效成分或脱出有害成分;

②选择适宜的溶剂(如CO₂)可在较低温度或无氧环境下操作,分离、精制热敏性物质和易氧化物质;

③SCFE具有良好的渗透性和溶解性,能从固体或黏稠的原料中快速提取出有效成分;

④降低超临界流体的密度,容易使溶剂从产品中分离,无溶剂污染,且回收溶剂无相变过程,能耗低;

⑤兼有萃取和蒸馏的双重功效,可用于有机物的分离、精制。但是,SCFE也存在缺陷,如萃取率低、选择性不够高。

2.微波辅助萃取

微波辅助萃取又叫微波萃取,是一种非常具有发展潜力的新的萃取技术,即用微波能加热与样品相接触的溶剂,将所需化合物从样品基体中分离出来并进入溶剂,是在传统萃取工艺的基础上强化传热、传质的一个过程。通过微波强化,其萃取速度、萃取效率及萃取质量均比常规工艺好得多,因此在萃取和分离天然产物的应用中发展迅速。

微波萃取的机理可由以下两方面考虑:一方面微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介内,到达植物物料的内部维管束和腺细胞内,由于物料内的水分大部分是在维管束和腺细胞内,水分吸收微波能后使细胞内部温度迅速上升,而溶剂对微波是透明(或半透明)的,受微波的影响小,温度较低。连续的高温使其内部压力超过细胞壁膨胀的能力,从而导致细胞破裂,细胞内的物质自由流出,萃取介质就能在较低的温度条件下捕获并溶解,通过进一步过滤和分离,便获得萃取物料。另一方面,微波所产生的电磁场可加速被萃取部分向萃取溶剂界面的扩散速率,用水作溶剂时,在微波场下,水分子高速转动成为激发态,这是一种高能量不稳定状态,或者水分子汽化,加强萃取组分的驱动力;或者水分子本身释放能量回到基态,所释放的能量传递给其他物质分子,加速其热运动,缩短萃取组分的分子由物料内部扩散到萃取溶剂界面的时间,从而使萃取速率提高数倍,同时还降低了萃取温度,最大限度地保证萃取的质量。

微波萃取机理的另一种描述为:由于微波的频率与分子转动的频率相关联,所以微波能是一种由离子迁移和偶极子转动引起分子运动的非离子化辐射能。当它作用于分子时,促进了分子的转动运动,若此时分子具有一定的极性,便在微波电磁场作用下产生瞬时极化,并以24.5×10⁹次/s的速度做极性变换运动,从而产生键的振动、撕裂和粒子之间的相互摩擦、碰撞,促进分子活性部分(极性部分)更好地接触和反应,同时迅速生成大量的热能,促使细胞破裂,使细胞液溢出来并扩散到溶剂中。在微波场中,不同物质的介电常数、比热、形状及含水量的不同,会导致各种物质吸收微波能的能力的不同,其产生的热能及传递给周围环境的热能也不同,这种差异使得萃取体系中的某些组分或基体物质的某些区域被选择性加热,从而使被萃取物质从基体或体系中分离出来,进入到介电常数小,微波吸收能力差的萃取剂中。

3.加速溶剂萃取

1995年由 Richter等人提出了一种全新的萃取方法——加速溶剂萃取法。该方法通过提高温度和增加压力来进行有机溶剂的自动萃取,是一种采用常规溶剂、在较高的温度和较大的压力下用溶剂萃取固体或半固体的新颖的样品前处理方法。该方法利用升高的温度和压力,以增加物质溶解度和溶质扩散效率,提高萃取效率。具有溶剂用量少,操作简单,萃取效率高,使用方便灵活,操作安全可靠,萃取残留少,样品回收率高等突出优点,已被美国国家环保局批准为EPA3545号标准方法。

当温度升高时,水的溶解度增加,有利于这些微孔的可利用性。温度的提高能极大地减弱由范德华力、氢键、溶质分子和样品基质活性位置的偶极吸引力所引起的溶质与基质之间的很强的相互作用力;能加速溶质分子的解析动力学过程,减小解析过程所需的活化能,使溶质从基质中解吸并快速进入溶剂;能降低溶剂和样品基质之间的表面张力,使溶剂更好地进入样品基质,有利于被萃取物与溶剂的接触。当增加压力时,液体对溶质的溶解能力远大于气体对溶质的溶解能力,而且增加压力也能提高溶剂的沸点,使溶剂在萃取过程中始终保持液态。

同传统的萃取方法相比,加速溶剂萃取具有萃取时间短和溶剂使用量少的特点。在处理时间上,传统的索氏提取需4～48h,自动索氏提取为1～4h,超临界流体萃取、微波萃取也需0.5～1h;而加速溶剂萃取缩短了样品前处理的时间,仅需12～20min,大大提高了残留检测的效率。在溶剂使用量方面,传统的索氏提取为200～500ml,自动索氏萃取为50～100ml超临界流体萃取为150～200ml,即使是微波萃取也要消耗25～50ml;而加速溶剂萃取仅需15ml,溶剂的消耗量降低90%以上,不仅减少了残留检测的成本,而且由于溶剂量的减少加快了样品前处理中提纯和浓缩的速度,进一步缩短了分析时间。另外,加速溶剂萃取通过提高温度和增加压力来进行萃取,减少了基质对溶质(被提取物)的影响,增加了溶剂对溶质的溶解能力,使溶质较完全地提取出来,提高了残留检测中的萃取效率和样品的回收率。

4. 亚临界水萃取

亚临界水萃取技术是近10年来刚刚发展起来的一种新兴的提取分离技术,具有提取时间短、萃取效率高、环境友好等技术优势,亚临界水萃取技术作为植物有效成分提取分离的新方法近年来得到了迅速发展,是一种很有潜力开发成为工业化生产的绿色提取技术。

萃取原理:在常温常压下,水是极性很大的溶剂,能很好地溶解极性化合物,但对低极性化合物的溶解性很低。在适度的压力下,将水加热到100℃以上临界温度(374℃)以下的高温,水体仍然保持在液体状态,这种水称为亚临界水,也称之为高温水、超加热水、高压热水或热液态水。亚临界水的物理、化学特性与常温常压下的水有较大差别,随着温度的升高,水的极性、表面张力和黏度都急剧下降,对中极性和非极性化合物的溶解能力会大大增加,其性质更接近于有机溶剂。亚临界水物理、化学特性的改变主要与流体微观结构的氢键、离子水合、离子缔合、簇状结构的变化有关。随着温度的升高,亚临界水的氢键被打开或减弱,水的介电常数很容易降低,水在常温常压下介电常数约为80,而升温升压至250℃、5MPa时,水的介电常数降低到27,这个值和25℃,0.1MPa下的乙醇相同,这表明亚临界水对中极性和非极性化合物具有一定的溶解能力。因此,通过调节亚临界水的温度和压力,使水的极性在较大范围内变化,就可以选择性地萃取无机或有机物质、极性或非极性有机物质表1列出儿种常用有机溶剂在常温常压下的介电常数以及水在不同温度下的介电常数。由于亚临界水萃取是以价廉、无污染的水作为萃取剂,而且具有较好的渗透与溶解能力,因此亚临界水萃取技术被视为绿色环保、前景广阔的一项变革性技术。

表1 水和有机溶剂的介电常数

5.基质固相分散

基质固相分散技术是 Barker在1989年首次提出并给予理论解释的一种快速样品处理技术。该技术的原理是利用分散剂(通常为C₁₈或C₈键合硅胶)颗粒的机械剪切力将基质分散,C₁₈键合相破坏脂质的细胞膜,使细胞成分释放在填料中重新分布,样品基质和待测组分按照极性相似相溶的规律分布在填料的表面。小的极性分子与填料表面未被键合的硅烷醇结合或形成氢键,大的弱极性分子则分散在键合相/组织基质形成的两相物质表面。由于待分析组分具有大的比表面积,从而可与洗脱溶剂充分作用,少量的溶剂即可有较高的提取率。其基本过程是将(固态、半固态或液态)样品直接与分散剂按样品与填料的比例大体为1:4一起混合和研磨,制成半固态物质,装柱后用类似固相萃取的方式用洗脱剂淋洗。根据作用原理,样品匀浆和提取在同一过程完成,因而减少了样品预处理步骤,降低了溶剂消耗,使分析速度得到提高,更可适于自动化分析。

影响基质固相分散的因素主要有分散剂种类和淋洗剂的选择。分散剂载体的孔径大小对样品预效果没有明显影响,而载体粒径大小则是相对较重要的影响因素。粒径在3～20μm时不易洗脱;粒径太大会使表面积太小,总的吸附能力减弱,净化效果变差,大多数情况下,以使用粒径为40μm的载体为宜。目前常用固相载体为反相键合相填料,以C₁₈用得最多,也有使用C₈和C₃₀的,还有采用氨丙基硅胶、正相填料和非键合分散剂(如硅碳镁土、氧化铝和硅胶)、一些惰性的物质(如沙、硅藻土或 Celite)代替正相或反相填料的。除了以上的常规吸附剂外,还有一些专属性强的分散剂,如含碳高分子材料、分子印迹聚合物等。在选择洗脱溶剂时应考虑到该溶剂对目标分析物的提取率及专属性,并能与后续的分析测定方法相适应等因素。洗脱溶剂的选择与分析物和载体键合相的性质密切相关。当分散剂为反相填料时,洗脱剂一般选用乙腈或甲醇;当分散剂为正相填料或非极性物质时,一般选用正己烷、二氯甲烷等。当目标分析物具有中等或高极性时,可选用乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲醇及水-乙醇等。另外,洗脱溶剂应优先考虑选择那些对人体危害小、成本低并对环境污染低的品种。