预处理和装柱
1. 将超纯水与沉降胶按1:3 比例悬浮,轻轻搅匀;
2. 将色谱柱固定到设备支架上,链接出口管道,从柱底端进口反向泵入超纯水,排除管道及筛板中的气泡,停泵,然后从出口端放出部分超纯水,保留1~2cm 高度超纯水,封死出口端,然后正向冲洗进口端管道和适配器,排除筛板和管道中气泡;
3. 通过玻璃棒引流将悬浮胶导入色谱柱,在柱上端补充部分超纯水,搅匀,装上适配器;
4. 将柱出口端与色谱设备连接,以0.2MPa 恒压装柱,装填至恒定的柱床高度,标记柱床胶面位置,关闭泵,松开适配器,降低适配器至胶面下2mm 处,继续装填,待柱床高度稳定后,标记柱床胶面位置,降低适配器至柱上标记柱床位置下2mm。固定适配器,继续装填2~3 柱体积;
5. 确定柱体积,测量柱高,计算柱体积及记录装柱时的最大流速;
6. 选择最佳线速,用0.5mol/L NaOH 冲洗柱,冲洗3~5 体积;
7. 接着用超纯水冲柱,冲洗10 柱体积,至pH 显示接近超纯水pH。
柱的平衡
20mmol/L 磷酸盐缓冲液,pH6.5,用10 柱体积平衡缓冲液平衡柱子,直至pH 及电导率监控显示与平衡缓冲液
的pH 及电导一致。
加样
根据柱体积及装柱的最大流速确定上样流速,上样流速不超过装柱最大流速的75%,同时,上样流速也要尽可能低,
保证样品和介质充分发生作用。
洗脱
上样结束后,用平衡缓冲液冲洗1~2柱体积,使UV280 响应信号重新回到基线。之后用含有0.5mol/L NaCL 的溶液洗脱,冲洗2~3 柱体积,收集色谱峰。