酶底物法已被列为国家标准(GB/T4789.32－2002)，用酶底物法来检测大肠杆菌的主要原理是:大肠杆菌细菌能够产生 β－半乳糖苷酶(β－D－galactosidase)，它能够分解 ONPG(Ortho－nitro phenyl－β－D－galactopyr－anoside)，从而使得培养基呈现黄色，来检测水样中是否含有大肠杆菌 。利用大肠杆菌内源性 β－D－葡糖醛酸糖苷酶(β－D－glucuronidase，GUS)可以将 4－甲基伞形－β－D－葡糖醛 酸 糖 苷 ( 4 － Methylumbelliferyl － － β － D －glucuronidase，MUG)分解为葡萄糖苷、甲基伞形酮，从而形成荧光特异性的产物，在长波 UV 光为 366nm下可见，并且产物的荧光强度与大肠杆菌的数量呈现正比的关系，利用所得的线性关系可定量检测食品中的大肠杆菌，但此方法与其他快速检测方法相比较而言，耗时较长。
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