培养箱内相对湿度的控制是非常重要的，维持足够的湿度水平才能保证不会由于过度干燥而导致培养失败。大型的二氧化碳培养箱是用蒸汽发生器或喷雾器来控制相对湿度水平的，而大多数中、小型培养箱则是通过湿度控制面板（humidity pans）的蒸发作用产生湿气的（其产生的相对湿度水平可达95-98％）。一些培养箱有一个能在加热的控制面板上保持水份的湿度蓄水池（humidity reservoir），这样可以增强蒸发作用，此蓄水池能增加相对湿度水平达97-98％。但是，这个系统也更复杂，由于复杂结构的增加一些难以预料的问题也会在使用过程中出现。
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