准备工作
1. BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix,内含PEZL四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaq DNA polymerase FS,反应缓冲液等。
2. pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2 g/L,试剂盒配套试剂。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2 μmol/L,即3.2 pmol/μl,试剂盒配套试剂。
4. DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 μl为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2 g/L,即200 ng/μl。
5. 引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2 μmol/L,即3.2 pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。
6. 灭菌去离子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 盖体分离。
8. 3 mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸馏水中,冰醋酸调pH至5.2,定容至100 ml,高压灭菌后分装。
9. 70%乙醇和无水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml无水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混匀,室温可保存1年。
11. POP 6测序胶 。
12. 模板抑制试剂(TSR) 。
13. 10×电泳缓冲液 。
14. 全自动DNA测序仪。
15. PCR仪。
16. 台式冷冻高速离心机。
17. 台式高速离心机或袖珍离心机。