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分子杂交技术-Northern杂交的操作步骤

2022.3.09
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coco5517

认真做好每一件喜欢的事,把每一件要做的事都变成喜欢并认真去做的事

  (1)RNA经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。转移方法与转移DNA的方法相似。

  (2)转移完毕后 ,以6×SSC溶液于室温浸泡此膜5分钟,以除去琼脂糖碎片。

  (3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小时。

  (4) 用下列两种溶液之一进行预杂交,时间为1-2小时。若于42℃进行,应采用: 50%甲酰胺,5×SSPE,2×Denhardt's试剂,0.1% SDS;若于68℃进行,应采用:6×SSC,2×Denhardt's试剂,0.1% SDS,(注意:BLOTTO不能用于Northern杂交)。

  (5) 在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mRNA,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108 cpm/分·μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24小时。

  (6) 用1×SSC、0.1% SDS于室温洗膜20分钟,随后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次,每次20分钟。

  (7) 用X光片(Kodak XAR-2或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。

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