材料与试剂
1、琼脂粉
2、平皿
3、打孔器
4、生理盐水或其他缓冲液，可加1/万的硫柳汞或叠氮钠防腐。
操作方法
1、称取一定量的琼脂粉，按1%左右（0.8%～1.5%）的比例加入生理盐水或缓冲液，水浴煮沸融化20min。
2、将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～3mm。自然冷却。
3、根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径）按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图。
4、挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。
5、在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。
6、以毛细滴管吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。
7、加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，37℃自由扩散24h～48h。
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