细胞培养基应具有一定的缓冲能力。细胞培养过程中造成细胞培养液 pH 波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2。在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，细胞培养液pH 很快下降；打开培养器具时CO2逸出则会引起pH升高。细胞培养基通常采用NaHCO3-CO2缓冲系统，按下列化学反应方程式调节细胞培养基的pH值：
H2O + CO2 → H2CO3 ⇌ H+ + HCO3－
NaHCO3 ⇌ Na+ + HCO3－
此外，还有缓冲能力较高的磷酸盐缓冲系统。但碳酸盐缓冲系统的细胞毒性小、成本低，在细胞培养中应用得更为广泛。另一种较为常用的缓冲液是HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）液，它是一种非离子两性缓冲液，在pH 7.0 ~ 7.2范围内具有较好的缓冲能力。高浓度的HEPES可能对细胞有毒性作用，细胞培养时HEPES的添加浓度一般为10～25 mmol/L。
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