植物合成
植物脯氨酸的合成有两条途径：一条途径是以谷氨酸(Glu)为底物合成脯氨酸，另一条途径是以鸟氨酸为底物合成脯氨酸，通常在植物受到胁迫或氮素缺乏的情况下，脯氨酸的主要来源就是谷氨酸合成途径，在氮素供应充足的情况下，植物中脯氨酸的主要合成途径是鸟氨酸为底物合成的。
化学合成
明胶、干酪素之类蛋白质的水解物，用离子交换树脂处理,再用苦味酸或雷因克特盐(Reineckeatesalt)处理中性氨基酸部分，仅使L-脯氨酸沉淀，最后用无水乙醇加异丙醇重结晶而得。由嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)XQ-3(由无锡轻工大学中央研究所选育)以氯化铵为氮源经发酵而得。产酸率约60g/L。
L-脯氨酸有两种制法。
一是直接发酵法，利用葡萄糖和黄色短杆菌变异株或谷氨酸棒杆菌野生株，经微生物发酵获得L-脯氨酸；
二是化学合成法，以谷氨酸为原料，与无水乙醇在硫酸催化下发生酯化，并加入三乙醇胺将氨基硫酸盐游离出来，得谷氨酸-δ-乙酯。
再用金属还原剂硼氢化钾还原谷氨酸-δ-乙酯，得脯氨酸粗品，最后对其分离纯化可得粗制脯氨酸。
小试工艺 酯化 称取L-谷氨酸147g，投入三颈瓶中，加入无水乙醇1L，搅拌冷却至0℃，再滴加H2SO4 80ml，于0-5℃搅拌反应1h，室温继续反应1h，反应全部变清。 在20℃下滴加三乙胺至pH为8-8.5，析出白色结晶，在室温下再搅拌1h, 静置冷却5℃过滤，取结晶，用95%乙醇洗涤，抽干后真空干燥，得谷氨酸-δ-乙酯约141g。熔点178-180℃，收率80%-83%。 [α]32D+29.8 (C=1g/ml 10% HCl)。
还原
在三颈瓶中投入谷氨酸-δ-乙酯175g，加入蒸馏水875ml，搅拌冷却至5℃，再分次加入KBH4 53.9g, 约1h加完，室温再反应1h，保温50℃反应3h。冷却至0℃，加入6mol/L HCl调至pH4，过滤取滤液，即得粗品L-脯氨酸水溶液。
分离纯化
离子交换树脂-氧化铝柱色谱分离法 将粗品L-脯氨酸水溶液，以4ml/min的流速进入装入732-H+型树脂交换柱中(1g 酸投料需10ml树脂)。 先用蒸馏水冲洗至中性,再用1mol/L氨水洗脱，收集含L-脯氨酸段的洗脱液(用硅胶G薄层色谱控制)。 将洗脱液减压浓缩至干，再用少量水溶解后，将其进入中性氧化铝色谱柱中，再以60%乙醇水溶液洗脱(还是用硅胶G薄层色谱控制)。 收集的洗脱液减压浓缩至干，再以无水乙醇洗涤数次，稍冷后再加入无水乙醚，冷却过滤取结晶，真空干燥，得L-脯氨酸。熔点220-222℃(分解),收率28%左右。 [α]24D-82.4 (C=1g/ml, H2O)。
五氯酚沉淀解吸分离法 成盐 将粗品制脯氨酸水溶液置于反应瓶中，加热至50℃时滴加五氯酚乙醇溶液 (0.111mol/70ml乙醇)，并保温搅拌5h后，让冷却至0℃，过滤取结晶，用少量冰水洗涤，抽干，干燥后得复盐,熔点240-242℃，沉淀率95%。
解析
将复盐38.4g，投入三颈瓶中，加入蒸馏水200ml，氨水20ml，室温搅拌8h，冷却至0℃后过滤取滤液，将滤液减压浓缩，加入蒸馏水100ml，过滤取滤液，加入活性炭脱色。乙醚提取，分出水层，继续浓缩至干，用无水乙醇脱色数次，再加少量无水乙醇湿润，加入2倍量无水乙醚，冷却结晶,过滤取结晶，真空干燥，得L-脯氨酸成品。 放大生产工艺 酯化 将L-谷氨酸15kg，无水乙醇100L投入200L反应罐中, 冷却至0℃，搅拌条件下滴加浓H2SO4 8.1L, 保持0℃, 搅拌反应1h, 再保温25℃搅拌反应1h后,加入三乙胺使pH为8.0-8.5。 搅拌1h, 出现白色沉淀。 冷却至5℃, 过滤取沉淀，用50L 95%乙醇洗涤，沉淀于50℃真空干燥，得L-谷氨酸-δ-乙酯。
还原
将所得L-谷氨酸-δ-乙酯投入100L反应罐中，加水70L，搅拌冷却至5℃，于1h内分次加完4.3kg KBH4，加热保温200℃，搅拌反应1h，再升温50℃，搅拌反应3-4h，冷却至0℃，以6mol/L的HCl调pH至4.0，过滤取滤液得L-脯氨酸粗品溶液。
沉淀
将L-脯氨酸粗品溶液投入100L反应罐中，加热至50℃，在不断搅拌下缓缓加入7L 1.5mol/L的五氯酚乙醇溶液，保温50℃反应5h后，冷却至0℃析出结晶，过滤取结晶，抽干，得复盐。
解析、精制
将复盐投入100L反应罐内，加入3%氨水20L，室温搅拌反应7-8h后，降温至0℃过滤，沉淀用少量冰水洗涤，抽干，洗液和滤液合并，再减压浓缩至干，用10L去离子水搅拌溶解，过滤取滤液，并加入0.5%活性炭，加热70℃搅拌脱色1h，过滤取滤液，让其冷却至0℃，加等体积乙醚萃取，分出水层，减压浓缩至干，加10L无水乙醇脱水3次，抽干，沉淀加2L无水乙醇搅匀，再加10L乙醚，冷却至0℃，过滤取沉淀，真空抽乙醚，80℃烘干，得L-脯氨酸成品。
以明胶为原料用酸水解后经离子交换树脂柱层析而得。
烟草:BU,22;FC,21。
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