生物合成：在生物体内，DNA分子上的tRNA基因经过转录生成tRNA前体，然后被加工成成熟的tRNA：
tRNA前体的加工包括：切除前体分子中两端或内部的多余核苷酸；形成tRNA成熟分子所具有的修饰核苷酸；如果前体分子3′端缺乏CCA顺序，则需补加上CCA末端。加工过程都是在酶催化下进行的。
人工合成：1981年，中国科学家王德宝等用化学和酶促合成相结合的方法首次全合成了酵母丙氨酸tRNA。它由76个核苷酸组成，其中包括天然分子中的全部修饰成分，产物具与天然分子相似的生物活性（见核糖核酸和核酸人工合成）。
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