1.整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2.步骤⑷中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构,使Poly(A+)尾充分暴露,从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合,否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
3.十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4.寡聚(dT)-纤维素柱可在4℃贮存,反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5.一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%。