关于Southern杂交的预杂交的介绍

　　将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。具体步骤如下：

　　（一） 配制预杂交液：6×SSC，5×Denhardt’s试剂，0.5% SDS，50%(v/v)甲酰胺，ddH2O，100μg/ml鲑鱼精DNA变性后加入。注：1.每平方硝酸纤维素膜需预杂交液0.2ml。2.预杂交液制备时可用或不用poly(A)RNA。3.当使用32P标记的cDNA作探针时，可以在预杂交液或杂交液中加入poly(A)RNA以避免探针同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列结合。4.按照探针、靶基因和杂交液的特性确定合适的杂交温度（Thyb）。（如果使用标准杂交液，靶序列DNA GC含量为40%，则Thyb为42℃。）

　　（二）把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预热至杂交温度。

　　（三）将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一个稍宽于滤膜的塑料袋，用5-10ml 2×SSC浸湿滤膜。

　　（四）将鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。

　　（五）从塑料袋中除净2×SSC，加入预杂交液，按每平方滤膜加0.2ml。

　　（六）加入变性的鲑鱼精DNA置终浓度200μg/ml。

　　（七）尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，上下颠倒数次以使其混匀，置于42℃水浴中温育4h.