测序技术助力国家致病菌识别网对细菌性传染病的监测

2017年，国家致病菌识别网（Chinese Pathogen Identification Net, 简称China Pin）建立。依托国家、省、市、县四级疾控中心的实验室，通过收集病原菌的基因数据，建立以实验室为基础、基因数据和基础流行病学数据为支撑的“实验数据互联网”模式，来实现细菌性传染病病原检测鉴定、病原和流行特征分析、暴发疫情早期发现、病原学监测预警、溯源及风险评估等。

病原微生物全基因组测序技术、宏基因组测序技术在病原体识别、分子分型、耐药监测、溯源分析等方面发挥了重要的作用。在国家致病菌识别网的介绍文章中，提到“这些数据通过网络信息系统上传至省、市和地市级实验室的中心数据库中，用于建立各级实验室病原菌比较分析和追溯数据库。结合流行病学数据和实验室数据，网络实验室可对病原体分型聚类进行检测，并提出可能的聚集病例建议，为开展流行病学调查、发现潜在的疫情以及疫情的溯源提供数据支持，为细菌性传染病的监测和防控奠定坚实的技术基础。”

图1.国家致病菌识别网工作流程。

全世界每年有2700万人感染经由水传播的伤寒沙门菌。由于水中的伤寒沙门菌不易培养，使得在对水质进行调查时，容易漏检，造成潜在的公共卫生安全事件。加之抗生素的滥用，推动了多重耐药伤寒沙门菌菌株的出现和传播，其中泛耐药（XDR）伤寒沙门菌更难以治疗，是全球伤寒防控中重点关注的菌株，加大了伤寒沙门菌对公共卫生安全的威胁。

2022年2月，北京市昌平区出现一起聚集性感染事件，患者以高烧（最高达41℃）和腹泻为主，其他症状包括头痛、呕吐、恶心、咳嗽、冷漠、黑便，甚至肠道出血，这些病例均住在乡村的同一出租公寓内。北京市疾病预防控制中心联合昌平区疾病预防控制中心迅速开展了详细的流行病学调查，并对患者家庭用水开展了细菌分离、全基因组测序和耐药分析，最终确定了这是一起由泛耐药伤寒沙门菌经水体传播引发的伤寒暴发流行。

病原微生物全基因组测序结果表明，所有分离菌株均为ST1型，并且携带同一IncY质粒及相关耐药基因。将5个菌株的基因组序列提交给国家致病菌识别网数据库进行比较分析，结果表明这5株菌在系统发育树上聚为一类，与数据库中的其它伤寒沙门菌有明显的区别，与本地之前发现的菌株基因型都不相同。

这是我国首次报告的由广泛耐药的伤寒沙门菌污染饮用水导致的聚集性病例，病原微生物全基因组测序技术结合致病菌识别网数据库及分析流程，发挥了精准识别病原菌、分析其来源的作用。

图3. 5株泛耐药伤寒沙门菌的质粒图。

病原细菌耐药性是当前被密切关注的公共卫生问题。国家致病菌识别网除了对病原菌的监测外，耐药细菌及其携带的耐药质粒的监测也越来越引起疾控专家的重视。耐药质粒可作为一个独立的、完整的遗传单元，携带耐药基因在同种的和不同种细菌间活跃转移，造成耐药迅速扩散。通过基因组测序获得耐药质粒完整序列，更有利于明确分析耐药菌中的耐药质粒结构特征及其携带的耐药基因。研究团队通过来自公共数据库数据的400多条mcr基因质粒序列完成图，分析了其跨区域和跨宿主传播情况。研究论证发现有的耐药质粒会经由同种或多种宿主菌将耐药性传递到不同国家的动物、人、食品、环境中。作者认为，在细菌耐药监测中不仅关注耐药菌，还需要关注和开展质粒全序列测序分析，从这个活跃转移遗传因子的角度，监视、追溯耐药扩散，并在细菌监测网络中开展起测序、分析比对、追踪和耐药扩散风险评估。未来，在识别网网络实验室中，基于高通量测序技术对耐药基因的监测将发挥更加重要的作用。

图4. mcr基因型、质粒类型及与宿主菌的关系。

霍乱弧菌由200多个血清群组成。迄今为止，只有O1和O139血清群霍乱弧菌引起霍乱长时期流行。非O1 /非O139群霍乱弧菌只引起零星感染，很少引起暴发。

但是近年来，我国由非O1 /非O139霍乱弧菌引起的腹泻呈上升趋势。2020-2021年，广东就发生了两起非O1/非O139霍乱疫情，分别报告137例和79例感染者。广东省疾控中心从两起疫情中，分别分离到32和34株霍乱弧菌。通过对66株霍乱弧菌进行全基因组测序，并使用致病菌识别网集成的数据分析流程进行系统发育分析、毒力基因分析、血清群基因簇分析等，最终这些霍乱弧菌被确定为O5血清群。这是全球第一次报道由O5群霍乱弧菌引起的暴发。同时，基于全基因组序列的比对分析表明两起疫情分离的霍乱弧菌中97%（64/66）呈紧密聚类。由于O1和O139血清群之外的特异性诊断血清很难获得，不能通过传统的血清群鉴定方法进行非O1/非O139群霍乱弧菌的血清群鉴定，全基因组序列信息在血清群的鉴定方面发挥了非常重要的作用。自2012年以来，广东每年都报告由非O1/O139群霍乱弧菌引起的病例。作者认为我国目前的霍乱防控中，应注意针对非O1/O139群菌株的监测和新血清群菌株的发现与鉴定。

罕见病原体的发现和环境溯源：牛无形体由蜱虫携带，一直以来只在动物中发现感染，直到2019年发现了一例人感染病例。2019年，在安徽省同一乡镇，又报道了两例在野外被蜱虫叮咬造成的牛无形体感染人的病例，再次引起了公卫专家对自然疫源性病原菌监测的重视。随后在两例病例居住地和农活区域捕捉到蜱，通过基因扩增测序和序列比对，发现在环境中也找到该类病原体序列，并且基因与病人来源株高度相似，从而揭示了环境中存在携带牛无形体的蜱虫，也确定了病例感染来源。

在流行病中，以新型冠状病毒感染为代表的人畜共患病疫情在全球范围内对养殖业和人类健康都造成了非常大的威胁。据统计，人畜共患病每年会造成10亿例感染以及百万例死亡。过去的30年，有30种新发的病原菌感染人类，其中75%来自于野生动物。对野生动物进行病原学调查，可以及时发现潜在的人畜共患病病原菌及其流行情况，为公卫专家提供科学决策依据，在其造成大规模危害之前，提前干预、将损失降至最低。

图6. CLOSS模型野外采样、基因组测序及病原检测流程。

将宏基因组测序和病原鉴定发现建立在野外现场：目前野外监测工作中，面临着监测点固定、监测覆盖面小、样本采集后需要运输、检测时间长、且仅对特定病原体进行检测、检测病原种类不全面不灵活的问题。疾控移动实验室监测专家团队搭建CLOSS模型，解决了上述难点。CLOSS为Co-Localization of Sampling and Sequencing的缩写，指在开展野外环境病原体检测中，利用移动检测车在现场点完成采样和测序工作，并且是利用高通量宏基因组测序技术，在野外就地对野生动物携带病原体进行检测，通过移动实验室的转移开展多点连续监测，从而扩大监测面，能够对多种病原体及其环境分布情况进行调查。

通过建立移动测序实验室，可以实现流动监测，在采样地直接开始检测，节省时间，避免样品运输带来的生物安全问题，扩大监测覆盖度；且在移动监测中开展高通量宏基因组测序，可以实行病原一网打尽式的检测，突破目前检测中仅针对固定病原检测、缺乏多病原筛查和整体数据的限制。CLOSS模型未来计划整合进国家致病菌识别网，在多个网络节点（也就是多地野外环境中）实现对野外病原菌流行情况的实时监测和调查，可做为致病菌识别网监测中深入野外的灵活触角，是对疫情监测多点触发的有效补充。

调查团队表示：“尽管关于巴尔通体在国内的流行与传播情况掌握还不完善全面，但是之前出现的病例以及本次的调研结果表明有必要对巴尔通体阳性的野外动物和暴露在相关环境中的人类进行巴尔通体的进一步调查和监测”。凭借便携、易用、快捷的高通量测序仪，致病菌识别网首次完成了在野外通过高通量宏基因组测序技术对野生动物携带病原体的调查，实现了针对自然疫源性传染病病原菌的野外环境中测序监测。

病原微生物监测预警，保障国家生物安全和守护人民健康离不开先进技术、核心工具的助力。华大智造致力于成为“生命科技核心工具缔造者”，目前已形成基因测序仪业务、实验室自动化业务及新业务等三大业务板块。公司基因测序仪业务板块的研发和生产已处于全球领先地位，具备了独立自主研发能力并实现了临床级高通量测序仪的量产。

凭借多年的行业深耕与技术积累，华大智造基于公司核心技术快速整合，形成了病原微生物测序一站式产品组合。该组合可满足病原微生物全基因组测序、靶向测序和宏基因组测序全流程、不同应用场景的需求，为病原微生物的监测和预警提供国产化核心工具。

图：华大智造病原微生物测序一站式产品组合