荧光光谱仪原理

荧光光谱仪由激发光源、单色器、狭缝、样品室、信号检测放大系统和信号读出、记录系统组成。激发光源提供用于激发样品的入射光的来源。单色器用来分离出所需要的单色光。信号检测放大系统用来把荧光信号转化为电信号，结合放大系统上的读出装置可显示或记录荧光信号。
一.激发光源

因为物质的荧光强度与激发光的强度成正比，因此一种理想的激发光源必须具备稳定的光强、足够的强度和在所需光谱范围内有连续的光谱，此外激发光源的输出还应是连续平滑等强度的辐射。当然，这是理想化的光源，符合这些要求的光源实际上并不存在。通常仪器的激发光源主要采用氙灯、汞灯、氙-汞弧灯、激光器以及闪光灯。高压氙弧灯是应用最广泛的一种光源。
荧光光谱仪所用的激发光源为450W氙灯，这是一种短弧气体放电灯。该灯外套为石英，里面充氙气，室温时其压力为5atm，工作时压力约为20atm,氙灯的激发光谱在250～800nm呈连续光谱，在450nm附近有几条锐线。

工作时，灯内相距约8mm的钨丝间会形成强的电子流(电弧)，氙原子与其碰撞后会离解为氙正离子，氙正离子与电子结合就会发光。氙原子的离解发射连续光谱，而激发态的氙会发射位于450nm附近的线状光谱。工作的时候，氙灯发射出很强的灯光，其射线会损伤眼睛视网膜，紫外线会损伤肉眼角膜，因此操作者应避免直视光源。

二.单色器

光栅和滤光片都可以作为单色器。目前，现代精密的荧光光谱仪均用光栅分光器作为单色器(简称光栅单色器)，单色器部分均带有可调的狭缝，用以选择合适的通带。Fluorolog-3型荧光光谱仪狭缝的可调范围通常设为1～5nm。

1．光栅

光栅单色器有两个性能评价指标：色散能力和杂散光水平。通常，色散能力以nm/mm表示，其中mm为单色器的狭缝宽度。单色器的杂散光指标是一个极其关键的参数。杂散光是指除去所需要波长的光线以外，通过单色器的所有其他光线的强度。选用低杂散光的单色器可以减少杂散光的干扰，同时选用高效率的光栅单色器可以提高检测弱信号的能力。普通光栅单色器都有进光和出光两个狭缝，出射光的强度与光栅狭缝宽度的平方成正比。因此，适当地增大狭缝宽度有利于提高信号强度，但同时也会降低信号的分辨能力。而缩小狭缝宽度会有利于提高光谱分辨力，但却牺牲了信号强度。因此，为保证测试的真实性，针对具体的测试体系，狭缝的调节一般从小到大。另外，对于光敏性的荧光体在测量的时候有必要适当减少入射光的强度。通常激发单色器发出的紫外线用来激发荧光体，而氙灯中的紫外线强度很弱，仅约为可见光的1％。普通荧光物质的荧光一般都很弱，所以通过激发单色器的长波长的杂散光很容易被当作荧光来检测。例如，对于许多浊度较大的生物样品，入射的杂散光被其散射后就会干扰荧光强度的测量。因此，有些荧光光谱仪采用双光橱单色器，这样杂散光可降至峰强度的10-8～10-12,但是其灵敏度也将降低。

光栅单色器的透射率是波长的函数，定义机刻光栅的最强输出光的波长为闪耀波长。光栅的闪耀波长是由光栅的闪耀角决定，而闪耀角由光栅的线槽角决定。为弥补激发光源(氮灯)紫外区能量弱的缺点，荧光光谱仪多选用闪耀波长在紫外区(如300mn)的单色器为激发单色器。由于荧光化合物的发射波长多分布在400～600nm，因而发射单色器常采用闪耀波长为500nm左右的光栅。此外，光栅单色器的透射率与偏振光有关。

2.滤光片

消除来自杂散光和散射光的荧光测量的主要误差，还可以用滤光片。滤光片价格便宜、构造简单，因此它在荧光光谱仪中得到广泛应用。常用滤光片可分为玻璃滤光片、胶膜滤光片和干涉滤光片三种。该仪器使用的是玻璃滤光片。玻璃滤光片因为含有不同的金属氧化物而呈现不同的颜色。它们透过的光线带宽较宽，而且因受金属氧化物种类的限制，品种不多。但它价格便宜，又具有稳定、经得起长期光照等优点。

三.检测器

检测器的种类很多，主要有光电倍增管(photomultiplier-tube, PMT)、光导摄像管、电子微分器和电荷耦合器件阵列检测器。目前，几乎所有荧光光谱仪都采用PMT作为检测器。PMT是一种具有极高灵敏度和超快时间响应的将微弱光信号转换成电信号的真空电子器件，可用于光探测器件。在一定的条件下，其输出电流量与入射光强度成正比。检测器R928P PMT在真空管中包括光阴极和聚焦电极、电子倍增极和电子收集极(阳极)，根据光电子发射、多级的二次发射电极和电子光学的原理制成。光阴极在光子作用下会引起一次电子发射，这些光电子在真空管中被外电场加速，聚焦飞射到第一个二次发射极。这些冲击次级电极的光电子会使次极电极释放更多电子(5～20个)发生二次电子发射，这些电子又被加速并聚焦在下一个电极上去，这样重复多次，一般经过10次以上的倍增，放大倍数可达到108～1010，最后电子被集中到高电位的阳极上去，所产生的光电流就被放大到可检测的水平。PMT的光电子产生率与施加于光阴极的高压值的大小有关。一般PMT常用-500～-1000 V的电压，有些PMT则用-1000～-2000V。电压越高，每个二次电极发射的电子越多，因此PMT本身的放大作用就越大。

光导摄像管是用来作为光学多通道分析器的检测器。它具有动态范围宽、检测效率高、线性响应好、坚固耐用和寿命长等优点，尽管检测灵敏度不如PMT，但它能同时接受荧光物质的整个发射光谱，更有利于光敏性和复杂样品的分析。电荷耦合器件阵列检测器是一类新型的光学多通道检测器，具有灵敏度高、噪声低、光谱范围和线性范围宽、暗电流小、量子效率高，还可获取彩色、三维图像等特点。CCD检测器是一种灵敏的固体成像装置，一般其有效成像面积为1～8cm[1，2] 。

四.读出装置

早期荧光仪器的读出装置有数字电压表、记录仪(x-y或x-t型)和阴极示波器等几种。现在随着计算机软硬件技术的发展可以根据需求选择不同的直观读出方式。