检测DNA甲基化的方法有很多种，在众多方法中，研究人员常常会使用到一项技术，那就是亚硫酸氢盐转化。DNA的亚硫酸氢盐处理将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。随后用测序、定量PCR和芯片等分析来比较处理和未处理DNA的序列，就能确定哪些碱基是甲基化的。
尽管在理论上很简单，但亚硫酸氢盐处理真正要做起来却不那么容易。如果你问一问那些做过的人，他们八成会告诉你不好做。首先是回收率不高，会损失大量DNA，有时甚至达到50%。其次是转化效率，有时是未能彻底转化，有时则是转化过了头。此外，还要面临DNA的降解。因为亚硫酸氢盐处理的剧烈条件，DNA会片段化，从而降低了PCR及后续分析技术的灵敏度。
目前市场上有多个厂家提供亚硫酸氢盐转化试剂盒，包括QIAGEN、默克密理博、Sigma-Aldrich、Zymo、Life Technologies等。
在选购时，我们应注意关键的几点。首先，确保所有的未甲基化CpG位点都能完全转化，才能获得可靠的结果。另外，我们还要关心DNA是否能够高效回收。方法不同，实验所需的时间也有差异。传统的亚硫酸氢盐转化需要过夜孵育，而最新推出的试剂盒往往只需要1-3小时。
对于新手来说，最好还是买完整的试剂盒。试剂盒中的试剂和操作步骤经过优化，容易得到更加一致的结果。有些试剂盒中还带有对照。有些人可能觉得对照可有可无，然而一旦出了问题，它的重要性就凸显了。
默克密理博——CpGenome™ Turbo Bisulfite Modification Kit
这款极速重亚硫酸盐处理试剂盒能为你带来飞一般的感觉，让你体验极为快速的重亚硫酸盐转化。使用这一款极速重亚硫酸盐处理试剂盒，从DNA样品处理到转化后的高纯DNA只需90分钟。它的秘密就在于一款受ZL保护的处理试剂，能在很短时间内将未甲基化的胞嘧啶彻底转化。同时这种试剂对DNA的伤害又极小，不像通常的高盐、高温以及低pH等极端条件会导致DNA高度片段化。至于这种处理试剂的成分，我们当然无从得知，只知道它是由两种试剂混合而成。有了它，转化即可在40分钟内完成，耗时仅为其他方法的1/10。
也许你又有点担心转化的效果，快是快了，但会不会转化不完全呢？其实，这款试剂盒的修饰转化效率高达99.9%。无论是1 ng DNA，还是1 μg DNA样品，极速重亚硫酸盐处理试剂盒都一视同仁，产生灵敏且可靠的重亚硫酸盐转化结果。
有时，过度转化也是一个大问题。不过，极速重亚硫酸盐处理试剂盒可有一双雪亮的眼睛，只会彻底转化非甲基化的胞嘧啶，而丝毫不会转化甲基化的胞嘧啶！研究人员做过实验，用极速重亚硫酸盐处理试剂盒处理甲基化DNA和非甲基化DNA，然后用CpG Wiz® MGMT引物对进行测序。结果显示，在所有检测的样本中，极速重亚硫酸盐处理试剂盒仅特异地彻底地转化了非甲基化胞嘧啶，而完全没有转化甲基化胞嘧啶。这个特点最大限度地维护了我们实验结果的真实性和准确性。
QIAGEN——EpiTect Bisulfite Kit
QIAGEN的EpiTect Bisulfite Kit 采用简单的流程，可在6小时将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化成尿嘧啶，且手工操作极少，而传统方法需要18个小时。整个过程只需上样、洗涤、洗脱这几个简单的步骤。DNA经过热变性和亚硫酸氢盐转化后，被上样到EpiTect分离柱或96孔板上，使用优化的缓冲液和标准化的离心步骤或真空装置，洗去所有的亚硫酸氢钠并洗脱DNA。洗脱的DNA可用于各种下游应用，如甲基特异性PCR，定量PCR分析，亚硫酸氢盐测序，结合亚硫酸氢盐的限制性内切酶法分析（COBRA）以及焦磷酸测序（Pyrosequencing）。
以往，研究人员总是为转化效率太低而苦恼，而EpiTect Bisulfite Kit 采用全新的保护机制防止DNA降解，即使是1 ng的DNA也能获得灵敏的结果，转化率高达99%。而且试剂盒对不同的起始样品量一视同仁，无论是低至1 ng的DNA，还是高至2 µg的DNA，试剂盒都以相同的效率转化。对于微量样本，转化后的DNA还可用EpiTect Whole Bisulfitome Kit进行全基因组扩增。该试剂盒采用等温多重代替扩增（MDA）技术，可从50 ng 亚硫酸氢盐转化后的DNA 扩增得到1-3 μg DNA，足够下游100-300 次MSP实验使用。
至于转化之后的DNA回收，那向来是QIAGEN的拿手好戏。QIAGEN使用经典的硅胶膜技术，确保 85%以上的回收率，同时还可以高特异性地去除亚硫酸氢盐等对后续PCR有抑制作用的组分。
此外，试剂盒中的DNA保护缓冲液也非同一般。它采用独特的配方，防止DNA过度片段化，保证后续大PCR片段的扩增和分析，并实现有效的DNA变性，从而产生了转化所需的单链DNA。这一有效的完整DNA回收确保转化后的DNA可保存长达18个月，而如果使用自制试剂转化DNA，则只能保存短短的2-4周。DNA保护缓冲液还包含有pH指示剂染料，从而保证胞嘧啶转化时正确的pH条件。这款试剂盒的价格为2610元/48次，单次价格约为54元。
Sigma-Aldrich——Imprint® DNA Modification Kit
也许很多人都不知道，但Sigma-Aldrich真的提供了不少表观遗传学产品，包括亚硫酸氢盐修饰、ChIP等试剂盒，只是比较低调，宣传得不多而已。这款Imprint® DNA Modification Kit在性能上也确实不错，只需2小时即可完成整个转化步骤。DNA变性和亚硫酸氢盐修饰是同时进行的。在修饰过程中，亚硫酸氢盐与单链DNA反应，脱掉胞嘧啶的氨基，形成尿嘧啶。独特的DNA保护试剂防止DNA的化学和热降解。而捕获溶液能让DNA与过滤柱紧密结合，从而高效去除亚硫酸氢钠和盐。洗脱后的DNA立即可用，或储存在-20°C，最多2个月。
说明书中提到，对于最佳的修饰，DNA量应当在50-200 ng之间，不过100 ng-1 μg的DNA也可成功修饰。它提供了两种修饰步骤，供你灵活选择。若DNA量较多，如10 ng-1 μg，可选择一步法修饰；反之，若DNA在100 pg-10 ng之间，则推荐两步法。BSA可作为载体蛋白，改善低浓度DNA的回收，不过试剂盒中未提供，需自己另购。
除了快，Imprint DNA Modification Kit也极为智能， 99%以上的未甲基化胞嘧啶都能转化。至于处理和纯化后的DNA回收率，一般在50%以上。修饰后的DNA可用于下游的甲基特异性PCR、焦磷酸测序和甲基化芯片。试剂盒中包含了转化所需的所有试剂。50次反应的价格为2,577.51元，每次价格约为50元。
Zymo Research——EZ DNA Methylation™ kits
Zymo Research的DNA甲基化产品也是深受广大科研工作者的喜爱。它提供了三款亚硫酸氢盐转化试剂盒：EZ DNA Methylation Kit、EZ DNA Methylation-Gold Kit和EZ DNA Methylation-Direct Kit。
EZ DNA Methylation-Gold Kit 是EZ DNA Methylation Kit的改进版。EZ DNA Methylation-Gold Kit 将 DNA 变性过程和亚硫酸氢盐转化过程合成一步，使整个过程更快，可在3小时内完成。此步骤采用温度变性来取代之前方案中使用氢氧化钠的化学变性过程。转化之后，试剂盒可回收75%以上的DNA。
试剂盒的设计可以减少模板降解和纯化过程中的DNA损失，并且完全转化未甲基化的胞嘧啶。据Zymo介绍，转化效率在99%以上。回收的DNA对于PCR扩增、限制性内切酶消化、测序、芯片等下游分析是很理想的。
若你的样品量很少，Zymo还提供了另外一个好选择——EZ DNA Methylation-Direct Kit。它能够彻底转化来自血液、组织、细胞、FFPE和LCM样品中的DNA，而事先无需纯化。这款试剂盒的灵敏度更高，即使10个细胞或50 pg DNA也能对付，DNA回收率在80%以上。与上面的EZ DNA Methylation-Gold Kit一样，DNA 变性和亚硫酸氢盐转化是一步完成的。这几款试剂盒都有离心柱和96孔板形式可供选择。
Life Technologies——Cells-to-CpG™ Bisulfite Conversion Kit
Life Technologies的这一款试剂盒与上面Zymo的那个Direct有些类似，可以直接从细胞、组织或血液开始。直接裂解并变性样品，随后亚硫酸氢盐转化，脱盐，脱磺酸基，整个步骤在3小时内完成。若是从纯化的基因组DNA开始，需要100 ng至1 μg；对于培养的细胞，需要5000至105个；若是血液，则需要2.5 μl。
Cells-to-CpG™ 系统包含了从直接样品转化到纯化所需的全部组分，提供了一个经过验证、灵活简化的亚硫酸氢盐转化方案，适合实时定量PCR、毛细管电泳和新一代测序的流程。试剂盒有两种规格：50次反应和2×96孔板，供你灵活选择。
除了这个试剂盒，Life Tech还提供了两款对照，包括Cells-to-CpG™ Methylated and Unmethylated gDNA Control Kit和Cells-to-CpG™ Bisulfite Conversion & Quantitation Control Kit。结合这些经过验证的对照，Cells-to-CpG™ Bisulfite Conversion Kit可为大家带来定量上可靠的结果。
对于亚硫酸氢盐转化这个过程来说，我们的目标是实现未甲基化DNA到尿嘧啶的~100%转化，同时最大限度地回收DNA。新产品的不断出现，让我们离这个目标越来越近了。
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