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DNA聚合酶I的二级结构以螺旋为主，可划分为A至R共18个螺旋肽段。螺旋肽段之间由非螺旋结构连接。其中H区与I区之间的无规则结构较长，有50个氨基酸残基，I螺旋与O螺旋之间由较大的空隙，可以容纳DNA链，而50个氨基酸的无规结构，就像一个盖子那样与I、O螺旋区共同把DNA链包围起来，使其向一个方向滑动。DNA聚合酶I只能催化延长约20个核苷酸左右，说明它不是复制延长过程中起作用的酶。DNA聚合酶I在活细胞内的功能，主要是对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。[1]
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