1895年11月8日傍晚，他研究阴极射线。为了防止外界光线对放电管的影响，也为了不使管内的可见光漏出管外，他把房间全部弄黑，还用黑色硬纸给放电管做了个封套。为了检查封套是否漏光，他给放电管接上电源（茹科夫线圈的电极），他看到封套没有漏光而满意。可是当他切断电源后，却意外地发现一米以外的一个小工作台上有闪光，闪光是从一块荧光屏上发出的。然而阴极射线只能在空气中进行几个厘米，这是别人和他自己的实验早已证实的结论。于是他重复刚才的实验，把屏一步步地移远，直到2米以外仍可见到屏上有荧光。伦琴认为这不是阴极射线了。伦琴经过反复实验，确信这是种尚未为人所知的新射线，便取名为X射线。他发现X射线可穿透千页书、2～3厘米厚的木板、几厘米厚的硬橡皮、15毫米厚的铝板等等。可是1.5毫米的铅板几乎就完全把X射线挡住了。他偶然发现X射线可以穿透肌肉照出手骨轮廓，于是有一次他夫人到实验室来看他时，他请她把手放在用黑纸包严的照相底片上，然后用X射线对准照射15分钟，显影后，底片上清晰地呈现出他夫人的手骨像，手指上的结婚戒指也很清楚。这是一张具有历史意义的照片，它表明了人类可借助X射线，隔着皮肉去透视骨骼。1895年12月28日伦琴向维尔茨堡物理医学学会递交了第一篇X射线的论文“一种新射线——初步报告”，报告中叙述了实验的装置，做法，初步发现的X射线的性质等等。X射线的发现，又很快地导致了一项新发现——放射性的发现。

　　自伦琴发现X射线后，许多物理学家都在积极地研究和探索，1905年和1909年，巴克拉曾先后发现X射线的偏振现象，但对X射线究竟是一种电磁波还是微粒辐射，仍不清楚。1912年德国物理学家劳厄发现了X射线通过晶体时产生衍射现象，证明了X射线的波动性和晶体内部结构的周期性，发表了《X射线的干涉现象》一文。

　　劳厄的文章发表不久，就引起英国布拉格父子的关注，老布拉格（WH.Bragg）已是利兹大学的物理学教授，而小布拉格（WL.Bragg）则刚从剑桥大学毕业，在卡文迪许实验室。由于都是X射线微粒论者，两人都试图用X射线的微粒理论来解释劳厄的照片，但他们的尝试未能取得成功。小布拉格经过反复研究，成功地解释了劳厄的实验事实。他以更简洁的方式，清楚地解释了X射线晶体衍射的形成，并提出了著名的布拉格方程：，这一结果不仅证明了小布拉格的解释的正确性，更重要的是证明了能够用X射线来获取晶体结构的信息。