糖化血红蛋白的检测方法

1、阳离子交换色谱法
原理：糖化导致血红蛋白分子表面阳离子丢失。在弱的阳离子交换剂中，例如Biorex70，伴有增加的离子浓度和（或）pH下降，糖化血红蛋白在非糖化血红蛋白前先洗脱。这现象产生了糖化血红蛋白最初的术语“快速血红蛋白”。阳离子交换色谱法可用于小型、微型或大型柱层析方法或部分或全自动的PHLC/FPLC方法。因为，其他翻译后修饰血红蛋白，例如醛亚胺型、甲酰化、乙酰化、乙醛加合物、降解物、老化人工物品和异常血红蛋白电荷交换也不同于正常的HbA0，所以已经列出了许多阳离子交换层析法的干扰因素。使用常规HPLC的方法。分离糖化血红蛋白亚组分是能达到满足需求的临床精密度。然而，已知HbA1c的峰不是均一的而是包含一重要的非糖化血红蛋白部分。少数糖化血红蛋白也整合到HbA0主峰中。通过使用特殊的柱原料（poly-CATA）和30～40 min分离时间可以改善分离效果。这些方法可以作为参考步骤但不适合常规使用。所有的阳离子交换色谱法对pH和温度的变化敏感，因此要控制pH和温度。
说明：根据红细胞代谢动力学推测初始HbA1c值大约每日破坏1/120（≈0.83%）。因为糖化在合适的治疗下甚至健康人也产生，故这个理论值在体外不能达到。控制不理想的糖尿病患者通过加强治疗而达到血糖量正常，可以发现HbA1c值最大下降率以大约每10 d下降正常血糖的1%（绝对的）。由于测定糖化血红蛋白方法的精确性，两次测定值HbA1c的差异大约1%就可认为具有临床相关性。因为这些原因，在HbA1c两次测定间至少有2周的时间，推荐4～6周的间隔。
因为升高的糖化血红蛋白值是长期高糖血症的糖尿病患者相当可靠的指示剂，因而是可能诊断糖尿病的。在未治疗的个体，正常的糖化血红蛋白值临床上可以排除明显的糖尿病。但由于它不能检测糖耐量受损，所以作为诊断和（或）筛选目的唯一的参数，使用糖化血红蛋白是存在问题的。
2、电泳法
原理：相比于非糖化血红蛋白，因糖化而变化的总电荷和糖化血红蛋白的等电点变化是琼脂糖凝胶或者pH梯度5.0～6.5的凝胶等电聚焦电泳分离的基础。琼脂糖凝胶电泳的血红蛋白亚组分分辨率很小，而等电聚焦可以更好地使亚组分分离。可能由于试验的自动化程度不足，重要性已经下降。
3、亲和层析法
原理：硼酸结合顺式-羟基。商品化的m-氨基苯硼酸琼脂糖共价结合的亲和柱已可用于微柱分析检测。将血样本中的血红蛋白加到层析柱后，所有的糖化血红蛋白（HbA1和旁链糖化的血红蛋白；总糖化血红蛋白）与硼酸结合而非糖化血红蛋白通过层析柱可被测量。在加入高浓度也包含顺式-羟基的多羟基复合物，例如山梨醇后，糖化血红蛋白与硼酸的结合被替换而从柱子上洗脱下来。亲和层析法对经翻译以后修饰的血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对不敏感。利用亲和层析法，仅能测定总糖化血红蛋白。广泛使用的亲和层析方法，允许用经验算法从总糖化血红蛋白值计算出“标准的HbA1c”。
4、免疫分析法
在缬氨酸β-N-末端糖化的血红蛋白提供了一个容易被抗体识别的抗原表位。可以用单克隆抗体或多克隆抗体进行放射免疫分析和免疫酶学分析测定，抗体特异识别β链N-末端糖化的血红蛋白最后4～8个氨基酸组成的抗原表位。异常的血红蛋白或翻译后经修饰的血红蛋白无干扰。
目前的免疫化学试验不仅检测HbA1c，通常也同时检测HbA2c，因为血红蛋白A2糖化δ链的表位是相同的。抗体直接抗β-链的最后四个氨基酸的糖化表位的免疫化学试验也可用进行检测，例如HbS1c。在大多数情况下HbA2c意义不大，虽然镰刀细胞病时可以准确地测定缬氨酸β-N-氨基末端糖化程度，但它仍不能100%代表HbA1c。
5、离子层析法
离子层析法精密度高、重复性好且操作简单, 被临床广泛采用。检测原理由于血红蛋白β-链N 末端缬氨酸糖化后所带电荷不同, 在偏酸溶液中总糖化血红蛋白( GH b) 及H bA 均具有阳离子的特性, 因此经过阳离子交换层析柱时可被偏酸的缓冲液平衡过的树脂来吸附, 但二者吸附率不同, GH b正电荷较少吸附率较低, H bA 正电荷较多吸附率较高。用不同pH 的磷酸盐缓冲液可以分次洗脱出GH b 和H bA, 用KCN 可将H b转化为高铁氰化血红蛋白, 用分光光度计测定。或者得到相应的H b层析谱, 其横坐标是时间, 纵坐标是百分比。HbA1c值以百分率来表示。现在大部分都用全自动测定仪测定。
6、等电点聚集法
是测定GH b的新技术, 它是在聚丙烯酞凝胶中加人载体两性介质的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH 梯度, 溶血液中各个组份将移动到各自的等电点的pH 位置上, 这样就得到比一般电泳法更好的分划效果和比较集中的色带, 通过分辨率高的微量光密度仪扫描, 可以准确地测定出各自组份的含量。由于它能够分辨出一级结构不同的HbA、HbAc、HbF、HbS 及HbC等, 可完全避开各种物质的干扰。
7、化学发光法
采用离子捕捉免疫分析法, 应用抗原抗体反应原理, 联以荧光标记物, 通过连接带负电的多阴离子复合物, 吸附到带正电的纤维表面, 经过一系列彻底清洗等步骤后, 测定荧光强度变化率, 计算浓度。采用专用试剂包和免疫发光分析仪,其检测系统易于规范和重复, 可减少操作技术误差, 检测的灵敏度和特异性高, 批内、批间变异系数小, 回收率高, 准确度高, 交叉污染率小, 影响因素少。
8、酶法
原理为用特殊蛋白酶分解Hb, 3~ 5 min内果糖基氨基酸从H b分离, 果糖基氨基酸氧化酶( FAOD )从果糖基氨基酸产生H2O2, H2O2经POD与DA- 64反应, 选择751 nm 测吸光度改变求得GHb浓度。