药物筛选中分子生物学技术的应用研究

【引言】药物筛选是药物研发过程中的重要环节，它是针对有可能药用的各类物质，包括各类蛋白多肽、化合物、天然及海洋产物等，运用一定的筛选方法和技术，对其内部可能存在的具有药理作用的活性物质进行检测，并利用相应的方法，进行药用成分的提取与合成。药物筛选在药物的实验室研究到临床应用之间发挥了核心的桥梁作用。

随着分子生物学的不断进步，以分子生物学为应用基础的各类方法在药物筛选中获得了广泛的应用，例如高通量及高内涵筛选技术、反义核酸技术、生物芯片技术、基因工程技术、转基因技术、流式细胞术、免疫分析法等。分子生物学的基础是受体学说，针对受体进行研究能够加强对于药物作用、激素及神经递质作用的认识。针对受体的分子生物学相关研究，能够通过研究分子结构及基因序列推动人们了解各类物质结构与作用的关系，从而在细胞及分子层面研究受体进行生理病理调节的机制^[1]。分子生物学的发展使得人们对药物筛选的研究与应用提升到了分子水平，大大加速了药物筛选的技术进步。

1. 高通量及高内涵筛选技术

高通量及高内涵筛选技术是分子生物学的重要应用之一，高通量筛选((high throughput screening，HTS)和高内涵筛选((high content screening HCS)是针对单细胞水平进行多参数分析的细胞成像分析方法，高内涵筛选（HCS）是高通量筛选的一种补充技术，更加侧重于多细胞样品的无偏成像。HTS及HCS在药物筛选领域有着较为广泛的应用^[2]。与传统的药物筛选技术相比，HTS及HCS通过显微镜下的全自动成像及无偏成像从细胞样品获得了更加丰富的信息，同时能够在更为优化的生理生化环境中进行药物筛选研究，所获取的数据集更为丰富，对于药物筛选过程中所出现的各类问题有着更好的解释能力。

图1 高通量筛选及高内涵筛选技术

高通量HTS技术具有具有高效、快速、微量的特点，其筛选靶点包括酶、受体、离子通道，一般以单一模型针对大量样品进行活性筛选，主要分析方法包括光吸收、化学发光、荧光检测等，HTS技术能够建立可观的靶标及化合物库，在先导化合物的评价、优化、毒性研究等多个阶段均有重要作用，对于创新药物的研制有着重要的应用价值。

高内涵HCS技术主要在细胞分子层面进行多元分析，能够对细胞的生长过程、分化过程、凋亡过程以及其代谢、传导等进行全面的分析，筛选靶点包括细胞器、膜受体、胞内成分、离子通道等，HCS技术对于细胞表征的生理病理特征有更强的分析功能，其分析获取的先导化合物及阳性化合物有效率及成功率更高。

图2 高通量及高内涵筛选的应用 

相比较而言，高通量HTS技术更为侧重于同时能够对大量的样本进行检测，目前HTS技术已经进步到可以日筛选10万以上样本超高通量阶段。而高内涵HCS技术更侧重于对单个样本的分析所呈现的信息更为丰富。在药物筛\结合，能够在样本数量及微观丰富性方面大大提高药物筛选的可靠性及有效性。

2. 反义核酸技术

反义核酸技术是基因表达调控的一种作用方式，它是以mRNA具有互补作用的RNA分子，其基础的作用机理是与靶RNA进行碱基配对，反义核酸技术能够通过与特定的mRNA进行互补、阻断、翻译等作用，使得某些基因的表达实现封闭，体现为不表达或低表达的形式^[3]。反义核酸技术具有基因调节作用，对于有害及失控基因的抑制有着重要的作用。目前反义核酸技术主要包括反义RNA ( antisense RNA)、反义寡核普酸(an tisense oligonucleotide）、RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)等作用机制。

图3 反义核酸生化分子演变

当前，反义核酸技术主要应用于体内外模型中对于各项靶基因功能进行验证或检测，对于基因敲除技术有一定的替代作用。反义核酸技术能够通过高通量HTS技术的应用，大量快速的发现药物靶基因，并且能够特异性的对潜在靶点的基因作用进行控制与干扰，这一技术能够为药物的靶点发现以及疾病的基因治疗提供较为可靠的手段，该技术广泛的应用于基因治疗、基因组研究、转录调控研究等。

反义核酸技术应用与药物筛选之中，具有高度特异性、高生物活性、高信息量等优点，同时由于反义核酸没有被发现存在显著毒性，并且能够最终实现降解与消除，因此相比传统的药物筛选方法，其获取的药物更为安全、低毒。目前反义核酸技术在肿瘤、病毒感染、神经退行类疾病的药物筛选中有着重要的应用。

3. 生物芯片技术

   生物芯片技术的基本作用机制是通过微缩技术，利用分子生物学中特异性分子能够相互作用的原理，将不连续分析过程在硅芯片或玻璃芯片上进行集成，从而形成微型的化学生物分析机制，从而对各类生物组分进行快速高效的检测与筛选。生物芯片技术能够有效应用与药物筛选过程，通过测定分析可以对药物的靶点、活性、毒性、细胞表达等进行发现与评价。

图4 生物芯片技术应用演示

    依据固化内容物的差别，生物芯片可以分为基因芯片、多糖芯片、蛋白质芯片、神经元芯片等；根据作用原理的不同，生物芯片可以分为组件型微阵列、通道型微阵列、生物传感等多种类型的生物芯片，微阵列形式的生物芯片又称基因芯片(DNA Microarray)，是目前研究中较为成熟的在药物筛选领域有着重要应用前景的技术形式，尤其对于需要进行长时间追踪研究的药物筛选，这一方法有着尤为显著的作用。该方法能够针对上千个基因进行平行测定，对于有效靶点的发现作用明显^[4]。同时，该技术对于药物筛选过程中的化合物的基因表达变化能够进行较好的监测。目前的DNA Microarray主要的应用形式有两种，一类是对大量不同靶标的DNA进行分析，一类是对同一靶标的DNA通过不同探针序列的操作形式进行分析。

蛋白质芯片也在药物筛选中有着重要的应用，该技术突破了原有的应用较多的酵母双杂交技术的限制，能够通过功能性与检测性的蛋白质芯片实现对于药物筛选的体外研究。目前的主要分析手段包括核磁共振、质谱仪、高效液相分析等。

此外，组织芯片是一种将大量微小组织固化于某介质而组成的高通量微阵列，这一研究方法能够使药物筛选在DNA、RNA、蛋白质多个层面上进行平行研究，对不同层面的研究结果进行汇总并建立数据库，对于指标、靶点、抗体等的筛选具有显著的适用性。

4. 基因工程技术

基因工程技术是近年来分子生物学的重要进展，主要的技术形式是基因拼接及基因重组，该技术将不同类型的基因进行预先设计，而后在体外构建杂交的DNA分子，并将之导入活体细胞之后对原有的细胞特征进行改变。

图5 基因工程技术流程图

基因工程技术的出现使得从人体中提取受体或受体亚型成为可能，并将所提取的基因在哺乳动物的细胞或者某类微生物中进行重组，从而用于进行药物筛选模型的构建。这一技术的应用使得动物模型的有效性被大大加强，由于经过基因重组之后，实际的受体是从人体中提取的受体，通过该方法获得重组的受体，更为接近受体在人体中存在和发挥作用的状态，动物仅是研究的载体，因此其药物筛选的特异性与针对性得到了提升。这一方法的应用使得药物的筛选与制备获得了显著的突破^[5]。该方法的出现使得原有的只能在人体特定位置或特定环境中存在的受体获得了大规模的制备，从而降低了特定受体的药物筛选的难度。基因工程技术在胰岛素、干扰素、乙肝疫苗、白细胞介质等药物的制造出发挥了关键的作用，将基因工程技术继续应用于药物筛选，能够有效提高药物的特异性与筛选效率。

5. 转基因动物模型

转基因动物模型是通过对动物模型进行代际改良而获得医药目的的一种技术运用形式，其基本作用机制是运用外源性的基因，通过实验的方法导入动物染色体基因组内，通过实验筛选后获得能够将转入基因遗传到下一代的动物模型。转基因动物模型可以在药物筛选中用于疾病模型的制作，从而使得人类相关疾病能够通过转基因动物模型获得更具特异性的研究^[6]。通过动物模型的制备，特定的分子、细胞及整体情况能够在同一个动物模型中获得整合，对于特定疾病的药物筛选有着更为全面的模拟效果。

传统的动物模型一般通过外源干预的方法制作动物的疾病模型，由于疾病发生的过程、方式、诱因等存在较大的差异，因此相关药物的研制在应用于人体方面需要有一个较长的研究试验过程。转基因动物模型的运用能提升药物筛选对于人体的适用性，从而将这一过程大大缩短。目前转基因动物模型在抗肿瘤、抗肝炎病毒、抗艾滋病病毒、肾脏疾病药物等方面的研究发挥了重要的作用，但由于动物与人体不可避免的差异性，转基因动物模型仍然存在种族差异、转基因产物能否获得长期稳定表达、目的基因在试验过程中是否获得了完整的等位基因定位等问题。

6. 流式细胞术

流式细胞术是一种能够单次高速分析上万细胞的定量分析方法，该方法在细胞分子水平上运用抗体单克隆的方式对细胞或生物例子进行多参数分析。流式细胞术主要通过流式细胞仪进行操作，其分析速度快、准确度高^[7]。近年来随着分子生物学的发展，多种单细胞抗体和荧光探针在流式细胞技术中获得了广泛应用，通过荧光对细胞分子进行标记，细胞的受体、离子、胞内成分、配基等都能获得快速分析，在细胞凋亡、细胞抗药性检测、癌基因与抗癌基因检测等方面有着较好的应用，这些功能使得流式细胞术能够较好的用于创新药物的筛选。

图6 流式细胞术细胞分析

流式细胞分析的优点在于对于细胞的分子层面的分析较为全面，目前已经实现从单色到多色的荧光分析，细胞膜到细胞内微观成分的分析，细胞内可溶成分分析，分子表型分析等多种技术的应用。在药物筛选方面，流式细胞术能够通过对细胞凋亡的观察与监测提高药物研制的针对性，在细胞凋亡研究中，流式细胞术能够对DNA、膜成分、肌动蛋白、磷脂成分等的改变状况进行具体测定，并根据测定的结果为药物筛选提供一定的有效参考。

7. 免疫分析法

免疫分析法是药物筛选中一种常用的分子生物学分析方法，其基本原理是可溶的抗体和抗原在接触时能够形成不相容的抗体抗原复合物，并发生可观察课测量的沉淀作用。该方法主要利用抗原以及抗体的特异性，根据其对药物、蛋白、微生物、激素等的反应进行特定的分析。目前，免疫分析法较为主要的分析技术包括放射免疫分析、化学发光免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析等。

免疫分析法能够对生物利用度以及药物代谢参数等具体的指标进行详细的测定，从而了解药物在试验过程中的吸收及作用情况，在对药物的毒性试验、浓度试验方面，免疫分析法也有很好的适用性^[8]。免疫分析法能够对试验中的细胞分子的各类有效成分进行具体的含量测定，对于药品中是否含有某种特定物质，以及特定物质的影响作用均能进行有效的指标评价。

8. 展望

    药物筛选是创新药物研发的必经阶段，其筛选效率及其有效性对于后续的药物研发有着重大的影响。运用各类分子生物学技术，推进药物筛选向更为微观更为精准有效的方向发展，为药物的筛选与制备提供更有效的指标参考，对于提升药物研发速度，降低研发成本有着重要的意义。各类新兴的分子生物学技术为药物筛选提供了新的模型与方法，而各类方法的相互融合组合利用，对于未来的创新药物开发能够提供更为有效的技术支持。

参考文献： 

[1] 刘翠, 杨书程, 李民,等. 药物筛选新技术及其应用进展[J]. 分析测试学报, 2015, 34(11):1324-1330.

[2] 宋萍, 马玉萍. 高通量筛选技术在药物研究方面的应用[J]. 医学信息, 2015(27):382-383.

[3] 易浔飞, 兰小鹏. 反义核酸技术应用难点及研究进展[J]. 生物技术通讯, 2007, 18(4):655-659.

[4] 董艳. 基于基因芯片分析的药物分子作用靶标预测[D]. 东北师范大学, 2015.

[5] 王光寅, 谭婷婷, 潘祖亭,等. 生化药物和基因工程药物研究概述[J]. 煤炭与化工, 2009, 32(10):5-7.

[6] 王德利, 李志满, 田之宁. 转基因动物模型及其在医药学研究中的应用[C]// 中国实验动物学会学术年会. 2006.

[7] 周蓓. 流式细胞术在药学研究中的应用[C]// 抗菌药物研究与临床应用进展学术研讨会. 2005.

[8] 黄卫平. 免疫学分析法在检测滥用药物中的应用[J]. 中国药物滥用防治杂志, 2005(3):164-168.

摘要:药物筛选是新药物研究、制造、合成的必备过程，通过药物筛选，能够从已有的海量化合物中寻找到具有特定药物作用及治疗功能的新化合物，从而提高药物的研发效率，缩短其研发周期，起到降低风险减少成本的作用。随着分子生物学技术的不断发展，该技术的应用对于药理研究及药物临床应用的推进起到了极大的促进作用，提高了药物筛选的特异性，对于药物筛选效率及成功率的提升具有重要的意义。

关键词：药物筛选；生物技术；分子生物学；应用 

Abstract: Drug screening is an essential process in the research, manufacture and synthesis of new drugs,through the screening of drugs, it is possible to find new compounds with specific drug action and therapeutic function from the existing massive compounds,reducing risk and costs of drug manufacture,improve the efficiency and shorten the cycle of drug research and development.With the continuous development of molecular biology technology, the application of this technology has played a significant role in the promotion of pharmacological research and clinical application of drugs.It is of great significance to improve the screening efficiency and improve the success rate of drug screening.

Key words: drug screening; Biotechnology; molecular biology; application