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高内涵筛选的基本原理和应用

2021.10.14
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高通量药物筛选( high throughput screening,HTS)是20世纪80年代中期产生的为寻找先导物针对大量样品进行药理活性评价分析的一种技术手段,在创新药物的研究和开发中发挥了重要作用。近年来在药物发现领域又出现了一个新概念—高内涵药物筛选( high content screening,HCS) 。本文就高内涵药物筛选的一些情况作下介绍。

1 HCS概念

HCS是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下,同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响, 在单一实验中获取大量与基因、蛋白及其他细胞成分相关的信息, 确定其生物活性和潜在毒性的过程。同时, 也是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统,旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息, 在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术平台。

实际上,高通量药物筛选结果是单一的,而高内涵筛选的筛选结果是多样化的,它以多指标多靶点共同作用为主要特点,涉及的靶点包括胞内成分、细胞的膜受体、细胞器等。从筛选载体上看,高内涵药物筛选与高通量药物筛选并没有显著的区别,也在微孔板上进行,目前使用较多的是96孔微板。其优点是它的检测体积并未因检测指标增加而增高,操作步骤同样简单可行、自动化。

更重要的是, 获取信息是以细胞为单位,而不像是以微板孔为单位,这就意味着研究者可以从细胞群体中的各种反应获取信息,而不是像以前那样信息仅仅来源于一个微板孔中的所有细胞的平均反应。

2 HCS系统的组成

高内涵药物筛选实际上是样品制备、自动化分析设备、数据处理软件、配套检测试剂、信息学等多方面技术整和的结果,特别是电子荧光显微镜和荧光试剂对高内涵药物筛选方法的建立起到重要作用。HCS系统主要组成部分是:荧光显微系统、自动化荧光图像获取系统、检测仪器、图像处理分析软件、结果分析和数据管理系统和其它。

第一台高内涵药物筛选设备(ArrayScanÒ and KineticScanTM HCS Reader)是由Cellomics公司生产,该设备拥有全区域发光的白色光源带、多道滤光片和一个CCD( charge coup led devices)照相机。与荧光显微镜相配套在高内涵药物筛选中的常用试剂为荧光蛋白,对固定细胞或活细胞的动态分析都显示出高度特异性和敏感性,也正是荧光蛋白生物传感器的应用才使荧光成像显微镜在高内涵药物筛选中广泛应用。

目前中国已有多家科研院所引进了HCS系统。

3 HCS的应用

基于细胞的小分子库高内涵筛选已用于识别新的有治疗作用的先导化合物,目前已对十万余个化合物展开了基于图像的筛选。目前高内涵药物筛选主要在影响细胞功能方面应用,例如细胞毒性、G蛋白偶联受体调节剂、转录因子的活化、活性物质释放等。

分子转位实验在高内涵筛选策略中使用最为普遍。Lundholt等用CHO细胞进行了经胰岛素刺激的Akt1-EGFP融合蛋白转移实验,从45 000个化合物中获得了两类Akt1 迁移抑制剂。Cellomics和Xsira的科学家以GPCR为靶点,利用高内涵筛选技术,合作研究了GFP-β阻抑蛋白( arrestin)的迁移或受体内化作用,从640个化合物中,获得了3个活性化合物。

以细胞周期变化为检测参数也已用于小分子化合物的高内涵筛选。Perlman等从16 320个化合物中确证了35个活性化合物,其中5个被确定为特异性中心体复制抑制剂。同时,高内涵筛选正在不断将较复杂的毒性筛选实验变为一种被认可的简便方法。通过高内涵筛选技术对243个具有不同程度细胞毒性的药物进行肝细胞毒性测试发现,其敏感度为93% ,特异性达98%;而用其他方法检测611个化合物的结果表明,特异性很高( > 90%),但敏感度却很低( < 25% ) 。另外,在传统筛选中,所谓的筛选通量是由研究者依据个人工作速度决定的,而高内涵筛选可以在更短时间内完成对更多化合物的筛选。

4 结语

HCS不仅能阐明被筛样品与药物作用靶点的相互关系,而且可同时了解细胞的其他生物学改变,进而研究其对相关代谢途径的影响,并通过观察细胞形态来预测化合物的毒性。应用HCS技术能够加速发现具有潜在开发前景的活性化合物,设定深人评价的优先次序,为构效关系研究和结构优化改造提供有力的支持。因此,HCS代表着创新药物研究技术发展的必然趋势。

参考文献

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