什么是高通量筛选技术？什么是高内涵药物筛选？

【导读】高通量筛选是指以分子或和细胞水平的实验方法为基础，采用不同密度的微孔平板作为实验载体和自动化工具操作实验步骤，通过快速灵敏的检测装置在同一时间内对海量样品进行生物活性测定、采集实验数据和数字化分析处理，并以相应的信息管理软件支持整个系统正常运转的技术体系。高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。

1、什么是高通量筛选技术？

高通量筛选（High- throughput screening, ，HTS）是指以分子或和细胞水平的实验方法为基础，采用不同密度的微孔平板作为实验载体和自动化工具操作实验步骤，通过快速灵敏的检测装置在同一时间内对海量样品进行生物活性测定、采集实验数据和数字化分析处理，并以相应的信息管理软件支持整个系统正常运转的技术体系。

2、传统的药物筛选模式是怎样的？

传统的药物发现模式是在确定药物作用靶点及其功能和/或结构的基础上，采用各种实验手段，通过体内外多种模型对样品进行筛选，评价其生物活性和药理特征。根据活性分子的特点，进行化合物结构的优化改造，经动物毒理和药代动力学分析研究后确定药物先导化合物,进入人体临床试验。这种方法一般需要消耗大量的样品和实验动物，对技术人员的操作技能有较高要求，难以在短时间内对一定数量的样品开展有效和经济的筛选。随着各类化合物样品库储量的不断增加以及组合化学技术的应用，采用传统手段筛选海量样品不仅不可能而且极大地限制了新药研究之进程。

3、高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比有什么优势和局限？

高通量药物筛选在传统筛选手段的基础上，综合应用多种先进的技术成果和制造工艺，使药物发现的方式方法和理论模式产生了巨大的变化。高通量药物筛选技术以药物与靶分子或靶细胞之间的作用机理为依据进行生物活性分析，通过整合计算机控制、自动化操作、平行多道检测和数据采集处理等各个步骤，达到微量、快速、灵敏、准确的目标，是当代新药发现技术的重大进步，为全球各大医药公司和著名研究机构所广泛使用。

与传统的药物筛选方法相比，高通量筛选技术具有反应体积小，自动化，灵敏快速检测，高度特异性等优点。但是，高通量筛选作为药物筛选的方法，并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。

首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；

其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。但我们应该相信，随着对高通量筛选研究的不断深入，随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的发现以及筛选模型的新颖性和实用性的统一，高通量筛选技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。

4、高通量筛选由那几部分组成？

高通量筛选由五个技术元件组成：

（1）化合物样品库

拥有足够数量和结构各异的化合物样品是实施高通量药物筛选的基本条件之一。化合物样品库是由诸多具有不同属性的有机化合物所组成的，包括人工合成、天然产物和微生物次生代谢物等多种来源。

（2）特异性体外筛选模型

高通量筛选不仅要求微升级的反应体积，而且要求这种反应具有靶点特异性和检测敏感性，由此建立的筛选模型呈现出很高的技术含量。

（3）自动化操作系统

利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了地以图示体现机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温孵和离心等设备以进行相应的实验步骤。

（4）高灵敏的检测仪器

检测仪器一般包括液闪计数器、化学发光检测器、宽谱带分光光度仪和荧光光度仪等。

（5）数据处理管理系统

数据处理管理系统主要承担着化合物样品及其生物活性信息的收集、存储、分析、处理、整合和演绎的功能，为提供高通量药物筛选服务和药物发现与设计研究提供支撑。

5、化合物样品库是怎么建立的？

高通量筛选是一种利用已有的化合物进行的体外随机筛选。因此，通过高通量筛选发现的苗头化合物（Hit compounds）其有效性取决于被筛样品库的规模和质量。拥有足够数量和结构各异的化合物样品是实施高通量药物筛选的基本条件之一。化合物的质量主要表现在样品来源、组成种类、类药性、理化特性和纯度等方面。许多活性反应基团（Reactive groups）会使初筛的假阳性率大幅上升，将其剔除可以提高化合物样品库的质量。

化合物样品库是由诸多具有不同属性的有机化合物所组成的，包括人工合成、天然产物和微生物次生代谢物等多种来源。

（1）人工合成又可分为常规化学合成和组合化学合成两种方法。采用常规化学合成的纯化合物一直是国外制药企业化合物库样品的主要来源。它们通过长年累积的化合物建立样品库，通过购买和化合物交流使样品库的数量和质量不断提高。

组合化学（Combinatorial chemistry）的出现为大量增加化合物的数量提供一条有效途径。组合化学所要解决的根本问题是怎样快速地得到大量结构多样、覆盖面广的化合物样品。它要求组合有限的几种化学试剂以获得尽可能多的产物。因此，同一组试剂应具有相同的反应基团，彼此之间的差别仅在于不参与合成反应的其他基团的不同。一步反应所得到的多种产物，实质上是同一类型结构略异的相似物；多步反应所得到的产物依然是同类型的，只是部分分子结构更多样、更复杂而已。然而，当不同的共性反应不是按先后顺序而是平行独立进行时，就能够获得类型不同、结构各异的多种产物。

目前常用的组合化学合成方法包括固相和液相两大类。固相合成即先把反应物连接到一个固相载体（通常是官能团化的高分子材料）上，然后在非均相的条件下进行有机反应，被广泛应用于大数目样品库的合成。液相合成采用一步多组分或一锅多步反应的经典技术，包括多组分合成法和官能团转换法，核心问题在于反应产物的高效分离提纯。多组分反应速度快、易操作，适用于合成数量大和多样化的化合物样品库。官能团转化法灵活方便，尤宜于数目较小的系列化合物样品库的制备，常用来进行结构修饰改造和构效关系研究。

（2）从天然产物里分离获得的单体化合物，其母核结构和活性基团是通过长期的自然选择而形成的，在筛选过程中所表现出来的生物活性具有人工合成化合物所无法比拟的优势。因此，结构多样的天然产物及其衍生物在创新药物的研究中具有极其重要的地位。长期以来，天然药物研究所采取的技术路线主要是以体内外药理活性跟踪检测为基础，从来源于陆地或海洋的动植物和微生物中提取、分离和鉴定有效成分，必要时进行结构修饰改造，最终确定药物先导化合物。在一般情况下，通过全合成、半合成或直接提取的方式能够解决原料之来源。为了加快新药发现的进程和提高研究效率，近年来科研人员创建了一系列新技术、新方法和新手段，如自动化平行和序列组合高通量制备和色谱—波谱联用高通量结构鉴定等，与高通量活性筛选技术相匹配，为快速测定各种天然产物样品在不同靶点上的作用特性创造了条件，可在短时间内获取大量的结构和活性信息。

6、药物筛选常用的靶标有哪些种类？

现代药物研究开发的关键步骤是发现、确定和应用药物作用的靶分子，即药物在体内发挥疗效的作用位点，包括基因、酶、受体、离子通道和核酸等生物大分子，其中酶和受体的用途最广。

（1）酶靶标

设为药靶的酶一般在疾病进程中与病理性代谢途径、信号转导、蛋白加工或免疫反应等密切相关。酶的小分子抑制剂如抗肿瘤药物氨甲蝶呤（二氢叶酸还原酶抑制剂）和5－氟尿嘧啶（尿嘧啶还原酶抑制剂）以及抗病毒药物阿昔洛韦（逆转录酶抑制剂）等在临床上已经广泛应用。也有将关键酶的上游调节机制或把酶本身作为药物的实例（如溶栓酶）。

基于酶动力学的筛选方法操作简易，灵敏度高，适于高通量和自动化。由于大部分反应都是在均相状态下进行，可明显减少实验误差，也无需繁琐的实时组织或细胞培养，从而提高了系统的稳定性。然而，无论是天然或重组的酶蛋白在分离纯化过程中都可因丢失某些关键成分或辅因子，或者掺入一些杂质而影响酶的活性。其次，在人工条件下的检测结果无法全面反映体内多种复杂的调控和反馈机制。再次，很多作为药靶的酶是与细胞膜相结合的，不易分离或分离后难以保证其生物活性。至于由多亚基组成的酶，如何在分离纯化后保持原有活性仍然是一个技术难题。因此，在建模时必须对特定酶的生物学特性（如生理效应、偶联反应、表达位点、组织分布、胞内定位、前体蛋白和同工酶等）、物理化学特性（如溶解性、分子量、等电点及稳定性等）和反应条件（离子浓度、pH值和纯度要求等）有比较详尽的了解。

（2）受体靶标

受体包括膜受体和核受体两类，占所有药物作用靶点的60%以上。膜受体的种类繁多，包括G蛋白偶联受体、配体门控离子通道、电压门控离子通道、酪氨酸激酶受体等。G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors，GPCR）是目前已知药靶中最重要的一类，约40%的市售处方药以其为靶点。迄今发现的1000多种G蛋白偶联受体尽管功能复杂多样，但结构却非常保守，其特点为7个跨膜的α双螺旋结构，其中N-端在胞外，C-端在胞内，通过相似的分子机制发挥生理作用，天然配体包括氨基酸、多肽、蛋白、脂肪酸和气味分子等。

核受体是目前所知最大的真核转录调节因子超家族，通过与特异性配体作用调节靶基因的表达水平。根据配体的化学性质，核受体可分为三类：（1）类固醇激素受体；（2）非类固醇激素受体；（3）至今尚未发现其天然配体的孤儿型受体。核受体发挥生理功能的经典途径是与细胞核内的DNA结合后激活或抑制靶基因转录，调节蛋白合成水平，引起相应反应。机体的生长发育、细胞分化和代谢凋亡等诸多生命过程都与核受体的作用密切相关，是一类重要的药物靶点。
受体结合试验发现的阳性化合物必须经过在活细胞内进行的功能检测才能确定其药理学特征，即激动剂、半激动剂、拮抗剂或半拮抗剂。对G蛋白偶联受体而言，可以测定细胞信号转导通路中信使或效应分子（如腺苷酸环化酶、磷脂酶C和蛋白激酶C等）的活性或三磷酸肌醇及钙离子浓度来间接反映受体的功能状态。由于核受体的信号途径非常复杂，精确定量其靶基因的活化水平十分困难，采用报告基因表达系统则能克服这一技术屏障。在某些缺少内源性受体及其下游信号通路必要组成的细胞中，通过共转染方法引入受体及含有受配体应答元件调控的报告基因，即可模拟受体的激活过程。根据报告基因转录和表达后所产生报告分子（如绿色荧光蛋白或荧光素酶等）的水平来判断被测样品的活性。在实验体系中转入监测质粒就能够用于区分细胞毒性和拮抗效应的差别。

7、常用的高通量筛选模型有哪些？

筛选模型是指用于检测药物作用的实验方法。由于高通量筛选要求反应总体积小、特异性强和敏感性高，因此对于筛选模型也有较高的技术标准。常用的筛选模型都在分子水平或细胞水平观察药物与靶点的相互作用，能够直接认识药物效应的基本机制。目前这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应方面。近年也出现了基因水平的药物筛选模型，使模型种类和涵盖范围更为广泛。

（1）分子水平的药物筛选模型：

① 受体筛选模型：指检测受体与放射性配体结合的模型。以受体为作用靶点的筛选方法包括测定功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。

② 酶筛选模型：观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点，底物和产物都可以作为检测指标，并由此确定反应速度。典型的酶筛选包括（a）适当缓冲液中孵化；（b）控制反应速度，如：温度、缓冲液的pH值和酶的浓度等；（c）测量产物的增加和底物的减少。

③ 离子通道筛选模型：举例为（a）贝类动物毒素高通量筛选的作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素结合位点，用放射性配体进行竞争结合来考察受试样品的活性特征；（b）用酵母双杂交的方法来高通量筛选能干扰N型钙通道β3亚单位与α1β亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。

（2）细胞水平的药物筛选模型：

主要观察被筛样品对细胞的作用，但不能反映药物作用的具体途径和靶标，仅反映药物对细胞生长等生理过程的综合作用，包括细胞激活、凋亡、增殖、转录调控、信号转导、蛋白分泌和离子流动等。

8、高通量筛选技术采用那些检测方法？

在液体移取、检测仪器、数据处理和高密度微孔板应用取得巨大进展的同时，检测技术的进步乃是提高筛选效率和命中率，使筛选系统完全自动化的重要环节。均相筛选技术主要应用于体外生物化学的检测，其靶点包括特定的酶、受体或离子通道，具有快速、价廉、重现性好等优点。传统的筛选技术，如受体配体结合、酶和细胞水平的筛选均为多步骤方法，通常会涉及到过滤、沉淀或吸收以及数次洗涤过程以分离结合与游离的配体或底物与产物。如曾经非常流行的ELISA方法，包括几次孵育和洗涤步骤，劳动密集度高，即使优化后，日筛选最大通量仍然小于5000样次。而那些使用同位素标记底物或配体的检测方法，则会产生大量的放射性废物。另外，这些实验技术均不能完全适用于自动化操作，检测过程中每增加一步都会延长完成实验的时间，降低信号，减少通量。而高通量均相筛选技术却能弥补这些缺陷，日筛量可达一万样次以上，对于建立高效快速的筛选体系至关重要。

国际上近些年来发展了许多基于荧光、化学发光或放射性活性检测的新技术。而更为新兴的纳米技术，包括生物芯片及"量子球"（Quantum dots），使更高密集度形式的超高通量筛选成为可能。目前，基于荧光检测技术的高通量筛选方法包括：荧光强度检测、荧光偏振检测、荧光共振能传递检测、均相时间依赖荧光检测或均相时间依赖荧光共振能传递检测、共聚焦荧光显微镜、荧光成像分析和荧光报告基因检测等。基于化学发光检测技术的高通量筛选方法包括：电化学发光检测、荧光素酶报告基因检测及Alpha筛选检测等。基于放射性活性检测技术的高通量筛选方法包括：近亲闪烁检测方法、FlashPlate闪烁检测方法和LEADseeker均相成像检测等。另外还有表面膜共振检测、液相色谱质谱联用检测和毛细管电泳质谱联用检测等先进的技术手段。

细胞分析技术能够精确模拟活细胞的内环境，可用来验证化合物样品对细胞功能的影响，如增殖分化、信号转导和转录翻译等。常用的手段有放射性标记掺入法、四唑盐还原法、Alamar Blue实验、BrdU掺入法以及用于区别细胞毒性和增殖能力的荧光氧气探测技术等。

9、高通量筛选数据库有哪些功能？

高通量药物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进行随机和平行的活性检测，产生海量的原始数据，需要应用高效的数据库管理系统进行收集、存储、处理、分析、整合和演绎，其主要功能如下：

（1）样品信息的存储功能

数据库具有对用于高通量筛选的化合物样品进行存储管理的功能。处理一般信息如理化性质、纯度、来源、存量、位置等外，对每一个新入库的化合物都要事先进行新颖性分析，排除结构相同的化合物，避免重复筛选。由于高度反应性基团增加了假阳性出现的机率，在必要时还需对新入库的化合物进行反应基因检测。此外，数据库也保存对样品采取质量控制和质量保障措施的记录。

（2）活性信息的管理功能

数据库完整记录对库存每个化合物进行不同模型筛选获得实验结果，科研人员可以采用多种分析软件依此对其生物活性作出综合评价。

（3）药物筛选的服务功能

高通量药物筛选的工作量大，自动化程度高，也涉及到许多后继结果分析通报等繁琐程序。数据库管理系统能够对与药物筛选相关的业务往来通讯、档案管理以及各种样品标签的打印进行综合管理，使对外筛选服务各个环节有序化、标准化和流水化。

（4）药物发现的研究功能

高通量药物筛选产生大量的生物活性信息，数据库管理系统利用这些信息，通过对在同一模型上呈现阳性反应的化合物进行结构分析来判断是否存在初步的构效关系，或多种阳性结构是否存在一般规律，从而为后继研究提供参考。

10、自动化操作系统是怎么工作的？

高通量药物筛选在短时内要对数以万计的化台物样品进行活性检测，内容枯燥、步骤重复，人工操作容易因疲劳而出错。自动化操作系统采用微孔板作为反应容器，具有固定的分布模式（Format），不同的微孔板通过条形码加以标记。自动化操作系统通过光电阅读器对特定微孔板上的特定位置进行操作，并将实验结果及相关数据存贮在计算机内，从而使筛选过程快速有序，平行可控，易于重现，结果准确。

自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了地以图示显现机器的动作。科研人员可以自行编程，过程简单，便于操作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组成都分，根据需要可配置加样、冲洗、温孵和离心等设备以进行相应的步骤。

除了实验步骤的需要以外，自动化的加样方式是决定筛选速度的重要因素。目前主要有单孔、8孔、96孔和384孔等几种低中密度微孔板。单孔板一般用于对照样品以及复筛中零散样品的转移。96孔和384孔板在酶活性检测和需要同时开始与终止反应的筛选模型中是必需的。

自动化操作系统的另一个重要组成部分是堆栈（Hotel）。所谓堆栈是指在操作过程中用来放置样品板、反应板以及对它们进行转移所需的腾挪空间。因此，高通量筛选的样品数量取决于堆栈的容量。

我们都知道，生药的化学成分相当复杂，通过提取得到的提取物往往是大量单体组成的混合物，所以筛选前需要对生药的提取物进行适当的分离。在众多的分离手段中，制备型HPLC应该是最为理想的，它具有快速、高效、自动化等诸多优点。

由此可见，高通量药物筛选的自动化操作系统由计算机及其操作软件、自动化加样、冲洗、温孵和离心等设备以及堆栈这4个部分组成。不同的单位可根据模型类型和筛选规模选购不同的组分整合成为一个完整的操作系统。

11、高通量筛选系统的评价标准是什么？

对高通量筛选系统的正确评价可以判断整个药物筛选实验的质量和由此所获得结果之可靠性，主要指标包括可行性、稳定性、灵敏性和特异性，并引进了一些电子工程学的专业术语，如信号本底比（S/B）和信噪比（S/N）等。信号本底比反映实验中信号平均值与本底平均值之间的差距。一般来讲，S/B值越大，信号与本底的差距就越大，筛选模型对被测样品的区分度越大。在高通量筛选中一般要求S/B值大于3。信噪比是仪器分析中常用的评价参数。噪音系指在同样的条件下，本底所产生的记录信号。一般要求高通量筛选实验的S/N值大于10。

Z’因子巧妙地把信号的动态变化区间和信号变异性相结合，进行综合统计分析，弥补了单独使用信号本底比或信噪比的不足，因而被广泛接受，成为评价高通量药物筛选质量的最重要指标。Z’因子与S/B值和CV（变异系数）都有直接而密切的关系并以下式表示： 

Z’因子假定信号值和本底值的总体呈正态分布，而变异是由随机误差引起的，因而它能够反应信号值和本底值总体的分布。Z’因子是一个无纲量参数，它的绝对值从1～0。如果信号值总体与本底值总体重叠，Z’＝0。一般要求Z’因子大于0.4，即S/B＝3、CV＝10%，达到这一标准的高通量药物筛选实验结果才可接受。

在初建筛选模型时，必须根据实验产生的相关数据计算阳性对照物的EC50值或IC50值，与文献报道值进行比较可以基本判断模型的可行性。计算值与报道值在一定范围（一到两个数量级）内的差异对筛选结果的评估影响不大。

12、什么是高内涵药物筛选？

虽然由高通量获得的实验结果较为准确，易于评价，但其检测模型均建立在单个药物作用靶分子的基础上，无法全面反映被筛样品的生物活性特征，如化合物对细胞产生的多种特异效应包括毒性作用。显微荧光标记、数码影像分析以及图像数据处理技术的快速发展，使以高通量方式对细胞的多个生理环节进行检测成为可能，有力地推动了药物筛选技术由高通量筛选向高内涵筛选（High content screening, HCS）发展的革命性转变。高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。从技术层面而言，高内涵筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术，旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息。高内涵筛选技术的检测范围包括：靶点激活、细胞凋亡、分裂指数、蛋白转位、细胞活力、细胞迁移、受体内化、细胞毒性、细胞周期和信号转导等。

业界人士认为，高内涵筛选不仅能阐明被筛样品与药靶的相互作用关系，而且可同时了解细胞的其他生物学改变，进而研究其对相关代谢途径的影响，并通过观察细胞形态来预测化合物的毒性。应用高内涵筛选技术能够加速发现具有潜在开发前景的活性化合物，设定深入评价的优先次序，为构效关系研究和结构优化改造提供有力的支持。因此，高内涵筛选代表着创新药物研究技术发展的必然趋势。

13、要进行高内涵药物筛选需要什么基本设备？

开发高内涵筛选技术的最初目的是对样品在细胞水平进行功能性检测。美国Cellomics公司研制的ArrayScan HCS Reader是第一台专用于高内涵筛选的仪器，既可以单独使用，也能够与其他自动化设备联用。目前已有相当数目的仪器生产厂商开始研制这类仪器。制造商一般采用白色连续光源（或比较昂贵的激光光源）、多通道滤光片（适于常用的荧光染料）和CCD照相机分析固定细胞。对于活细胞的动态分析而言，白色连续光源因对染料的淬灭作用小和对细胞的光毒性低比激光更具优势，且可以长时间记录，适合于动力学研究。目前，高内涵筛选技术的应用已经从功能鉴定逐渐拓展到靶点发现、靶点验证、活性初筛、代谢及毒理等研究领域，显示了巨大的发展潜力。

图像采集、图像分析和数据储存是高内涵药物筛选设备的主要组成部分。其中用于图像分析的"生物应用软件"（BioApplications）大致可以分为两种：一种是针对某类特定生物学反应而设计的，研究人员能够在一定程度上通过修改参数来适应检测精度的需要；另一种为通用模板，使用者可以根据不同参数的自由组合来设计自己的应用软件。

实施高通量的高内涵分析在单位时间里会产生和采集数以万计的图像，必须及时处理和妥善保存。一个完整的高内涵筛选技术系统应该包括具有一定开放性的数据存储库，对不同来源的实验数据进行统一的分析和管理，同时允许研究人员从其他计算机终端调取信息，分析研究。

14、可否例举几个高内涵药物筛选的应用实例？

（1）受体功能检测

G蛋白偶联受体是最大的细胞表面受体家族，目前虽有200余个已经找到相应配体，但在人类基因组编码超过1000个的G蛋白偶联受体中仍有相当的数量不明其功能或配体，即孤儿型受体，为药物靶点研究领域的热点。这类受体的功能性研究大多基于胞内钙流测定、报告基因表达或受体内化检测。激动剂与受体结合引起后者构象改变而激活G蛋白，由此进一步调节下游分子靶标（如核苷环化酶、磷脂酶和激酶等）的活性，通过不同蛋白激酶级联反应催化受体磷酸化，与β-arrestins结合，发生G蛋白解聚，最终出现受体内吞。

多种自发性荧光蛋白的应用使得以细胞成像技术开展配体研究成为可能。在确立大多数G蛋白偶联受体被激动后从细胞表面内吞进入胞内这一普遍现象后多年，科学家才利用在β-肾上腺素受体C末段连接绿色荧光蛋白（GFP）的方式直观地记录了整个过程。研究表明，在受体C-末端连接荧光多肽不会干扰配体的结合，因而此技术可用于构建各种工程细胞株为筛选服务。Hirasawa等人曾经报告了利用GFP标记的受体以内吞为指标筛选孤儿受体GPR120配体的研究，发现不饱和长链脂肪酸可以激活该受体并刺激肠道分泌胰高血糖素样肽－1，最终导致胰岛素的分泌。β-arrestin与G蛋白偶联受体的相互作用对笼形蛋白（Clathrin）介导的受体内吞是非常关键的，这一作用能被以GFP标记的β-arrestin可视化。只有高亲和作用型的G蛋白偶联受体才能与β-arrestin同时内吞，GFP在细胞内重新分布，形成易于分辨和计数的点状小体，供研究者定量分析。

此外，也有人运用对pH 敏感的染料来监测G蛋白偶联受体的活性。CypHer-5是一种对酸度敏感的花青素（Cyanine）染料衍生物，pK 值为6.1，在酸性环境下可以检测到其产生的荧光。如果在受体的N-末端进行表位附加（Epitope tagging），选择标记CypHer-5的抗体进行染色，只是在受体激活后发生内吞进入酸性的内体（Endosome）时染料才会发出红色荧光并被检测到。实践表明，这种方法对Gs、Gi和Gq等结合的受体都适用，信号干扰少，可与绿色荧光蛋白标记平行使用。

（2）细胞毒性研究

早期、快速和体外毒性评价是提高药物发现效率和准确度之关键所在。当前已经实现高通量化的细胞毒性检测技术主要分为两类：一是基于线粒体活性的方法，如MTT法、Alamar Blue法和ATP生物发光法等；其次是基于细胞膜通透性的荧光染色法，如Propidium iodide等。随着对细胞凋亡通路的不断认识，上述仅仅判断细胞死亡而无法区分凋亡与坏死差别的细胞毒性检测方法已不能满足科研人员的需要了。

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，通过一系列严密调控的信号转导来实现，是机体主动、有序清除过剩或衰老细胞的生理机制。细胞凋亡早期会有磷脂酰丝氨酸外翻、细胞内氧化还原状态改变和线粒体膜电位变化等反应，在晚期则出现细胞膜通透性增加、细胞核裂解为碎块产生凋亡小体等现象。而细胞坏死是一个被动的、因损伤而引起的细胞解体、释放内容物之过程，往往伴随炎症反应等病理机制。荧光显微镜或流式细胞仪配合适当的荧光染料是区分凋亡或坏死最常用的手段。

高内涵筛选方法使实现荧光染色检测细胞凋亡高通量化成为可能。Vogt等人以3种荧光染料分别标记细胞核、线粒体和微管，应用ArrayScan对图像进行自动采集和分析，根据细胞密度、核形状、线粒体聚集状况以及微管形态变化等指标系统地分析了两个抗肿瘤药物（平阳霉素和紫杉醇）的毒性及其作用机理，体现了明显的技术优势。Lővborg及其同事也利用类似的办法评估了一种新型细胞毒药物（CHS828）的毒理学特性，结果满意。利用特定的生物应用程序（如Cell Health Profiling BioApplication）可以通过对不同检测指标展开组合旨在分析凋亡进程。

（3）信号通路分析

细胞信号转导通路本身和相互之间的交流调控方式极其复杂，传统的实验方法（如Western blot、凝胶迁移滞后检测和报告基因表达系统）繁琐耗时，无法研究单细胞反应。由于转录因子的核位移能以免疫荧光标记方法可视化，高内涵筛选技术使信号转导途径的高通量化研究成为可能。NF-B通路在炎症的发生和发展中起着非常重要的作用。IL-1和TNF等许多细胞因子都是通过激活NF-B通路来调节炎症反应的。Ding等人在1998年成功运用ArrayScan定量分析了由IL-1和TNF诱导的NF-B核位移。国家新药筛选中心的科研人员最近利用同样的方法确定了传统中草药瑞香狼毒的主要成分－异狼毒素的生物效应是由NF-B通路所介导的。

MAPKs通路是另一条涉及多种功能的信号转导途径，在抗肿瘤药物的筛选研究中尤为重要。ERKs是MAPKs的一个亚家族，活化后参与许多细胞内的反应，包括磷酸化重要的胞浆或膜蛋白、自身核转位、磷酸化核内转录因子进而引起细胞分裂或分化。由于MAPKs能被多种受体激活，转导多条信号通路，其功能必须受到严密的控制。高内涵筛选技术为能针对性地研究特定受体与某种MAPKs之间的关系提供了便利。例如，Ghosh等科研人员使用红色荧光标记的EGF刺激细胞而启动内吞，荧光标记配体与EGF受体结合后激活ERK信号转导通路造成ERK的磷酸化和核转位，两个反应在同一细胞内被同时检测量化并进行相关性研究，极大地提高了实验效率和降低了成本耗费。

（4）细胞形态观测

细胞的生理或病理反应往往会导致细胞形态的改变，如细胞器、大分子簇或细胞骨架在细胞内的位移；整个细胞形态或面积改变如神经细胞分化；细胞间距改变；细胞群落的形状、大小和其中每个细胞位置的变化等。这些变化有的是与正常的生理过程相关的，如受体内化、信号转导、迁移运动、有丝分裂和细胞分化等，而另一些则是受到外来刺激（包括化合物）后产生的：既可能同时发生，也可能以级联反应的形式出现。高内涵筛选技术自动定量和统计分析细胞形态变化的功能为高信息量地开展细胞生物学研究提供了强大的武器。Ghosh和Haskins报道了一个能自动对荧光标记细胞进行形态区分和定量分析的生物应用软件（Morphology Explorer BioApplication），使用者可从3个层面来研究细胞的形态改变：①全细胞形态；②亚细胞形态；③多细胞或细胞间形态改变。其中全细胞形态检测包括了形状、大小、突起的数量、长短和方向；亚细胞形态检测包括了细胞内颗粒或纤维的位置、数量和走向等；多细胞检测包括了细胞群落或多核细胞的外形、各细胞或核的分布情况等。化合物刺激或培养条件的改变有可能导致细胞骨架重新排列，从而使得细胞整体形态发生改变或者引起细胞之间距离或位置的变化。高内涵技术手段不仅可以快速记录这些形态变化，而且能够有效分析单一或混合培养细胞的群落形成、细胞铺展、胞内颗粒以及神经突触等现象，使筛选信息在多种层次上得以采集演绎。

（5）动态分析检测

早期活细胞功能检测所使用的染料大多是有机小分子，旨在测定细胞内金属离子浓度（如Ca2+等）、膜电位变化、细胞器定位和功能（如线粒体电位改变）等。随着荧光检测技术的不断成熟和在细胞生物学研究中的广泛应用，荧光标记开始向大分子方向发展。运用绿色荧光蛋白及其变异体使许多生物大分子的表达、分布、活化和位移过程可视直观。最近又有人把一类稳定性高、易于修饰、可发荧光的过渡金属硫化物应用到生物学的实验研究中，即"量子球"技术，其应用前景无限广阔。自动荧光显微技术和先进荧光试剂的产生使活细胞的动态可视研究进入了一个崭新的时代。

虽然上述高内涵实验技术经过短短数年的发展已经逐步整合到高通量药物筛选的实践中，但它仍然处在早期阶段，在仪器制造、图像处理和运转速效等方面都有待于进一步的提高。标记分子、常用试剂的开发也必须超越GFP和现有的荧光染料，以便开展更多的活细胞实时检测。最后，包括机器、试剂、耗材和软件在内的市售价格之实质性降低必将促进这项先进技术的推广与普及。