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(1)确定模板RNA完整性,无DNA污染。
(2)RNA模板中不应含有扩增反应的抑制剂。
(3)为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。
(4)使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
(5)若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
(6)设计引物时,避免在引物3’端含有互补序列,避免形成内部发卡结构。