荧光定量PCR扩增曲线形状异常的原因

A.扩增效率过高

    出现非特异扩增或引物二聚体：反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差，可能导致出现抑制PCR反应的现象。在绝对定量时表现扩增效率大于110%。

    解决方案：去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线；对目的基因做标准曲线，一般用质粒做梯度稀释，或用PCR产物做梯度稀释，然后做定量扩增，通过曲线评估反应效率。绝对定量有效的扩增效率在 90%-110%；重新纯化模板，去除模板中存在的潜在抑制物。

    B.扩增效率过低

    扩增效率过低主要表现在试剂浓度不适（主要是引物、镁和Taq DNA聚合酶，尤其是在多重实验中），引物对Tm之间的差异超过5°C以及热循环条件不适，试管中各种同源物质的竞争作用可造成反应效率低下。绝对定量表现：扩增效率＜90%。

    解决方案：对上述因素逐一排除后进行调整优化实验体系或选用Biog、ABI等质量比较稳定的试剂盒。

    C.个别扩增曲线异常

    如个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

    仪器设置不当引起的曲线异常：基线设置不当，如扩增曲线断裂或下滑：基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct 值- 4)，重新分析数据。

    Rox添加不当：表现为扩增曲线呈锯齿状且不连续，需校正参比染料。