取步骤一所制备的DNA[40μg/ml，溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的灭菌5ml塑料管中，缓慢加入31μl 2mol/l 氯化钙（温和混合30s左右）。于室温育20～30min，其间将形成细小沉淀。温育结束时，用吸管将混合液吹打一次，使沉淀物悬浮。
通常采用的另一方案是将氯化钙和DNA的稀释混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按步骤一制备并溶于氯化钙（250mmol/L）的DNA。按照前述方法温育之。
如果需要转染更为大量的细胞，上述两种反应混合液的体积均可翻一番或翻两番。如果体积翻两番，则须使用更大的塑料管，一般在25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿上，可将0.5ml磷酸钙-DNA共沉淀物加入5ml培养液中，而在90mm细胞培养皿上，一般将1ml沉淀物加入10ml培养液中。
已经发表的方案中，混合各组分的方式与速率大不相同。其中有一些认为除了温和振摇之外，其它措施均无济于事，并建议用电动移液装置吹出的空气来混合溶液。其它一些方案则规劝在加入DNA溶液时连续而缓慢地混匀，然后再温和振荡。其目的是为了避免急速形成粗沉淀物，以致降低转化效率。实际上，除了混合的速度之外，还有其它若干因素包括DNA的浓度和大小（让高分子量DNA从细针头中通过，可将之剪切变小）、缓冲液的精确pH（有些工作者配制了几批pH范围从6.95至7.1不等的HBS缓冲液，逐批试验沉淀物的质量及转染效率）。如果必须使转染效率达到最高，就要花时间针对特定的系统优化上述几种因素。一旦得到一批灵验的试剂，只需依照前面方法进行配制和贮存，即可在长期内获得可重复的结果。
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