分析测试百科网

搜索

喜欢作者

微信支付微信支付
×

关于转移基因表达和细胞集落形成的介绍

2022.11.09
头像

coco5517

认真做好每一件喜欢的事,把每一件要做的事都变成喜欢并认真去做的事

  ①瞬时表达:在转染后48~60h收获细胞,进行RNA或DNA杂交分析。新合成的蛋白质可以用放射免疫测定Western印迹,体内代谢标记-免疫沉淀或者细胞提取液中酶活性的测定等方法来进行分析,如果测定中有重复品或者转染细胞要经过多种不同条件或在一段时间历程以内取不同时间进行处理,就要避免皿与培养皿之间转染效率的偏差。在这些情况下,最好转染大片的单层细胞(90mm培养皿),培养24h后用胰蛋白酶进行消化,再分接到若干较小的培养皿上。

  ②稳定转化:在非选择性培养基中培养18~24h,使所转移基因得到表达之后,用胰蛋白酶消化细胞,种入适当的选择性培养基中。这种培养基在2~3周内每2~4d须更换1次,以便除去死细胞残骸并使抗性细胞集落得以生长。

  可以克隆单个细胞集落,增殖后进行测定。可以用冰预冷的甲醇将仍保留在培养皿内的细胞固定15min,再于室温用10%Giemsa染色15min,最后用自来水冲洗,这样即可得到细胞集落数的永久记录。Giemsa染液可用PBS或水现用现配,并用Whatman 1号滤纸过滤。

  重新接种细胞以便取得分隔良好的细胞集落所要求稀释倍数,主要由稳定转化的效率来决定。这一效率可以相差若干个数量级,它起决于:a.受体细胞的型别(即使同一细胞系,克隆不同或传代数不同,也表现出显著差异);b.导入基因的特性及其转录调控信号强弱;c.转染中所用供体DNA的量。

互联网
文章推荐