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①目的蛋白质被乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化，应选择去修饰剂以恢复原有目的蛋白质大小；
②目的蛋白质降解，制备样品时应使用蛋白酶抑制剂，并使用新鲜标本；
③抗体浓度过高，应适当稀释抗体；
④目的蛋白质存在二聚体或多聚体，样品应充分煮沸10min，使蛋白质彻底变性再上样。
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