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DNA分子杂交的基础是，具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。
在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分子分离成为单链，这个过程称为变性。然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链事先用同位素进行标记。
如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区。
由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出。
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