虽较直接检查法为慢,且较为复杂,但更准确,应用范围也更广,几乎可用于所有的病原体。一般除病毒、衣原体和立克次氏体外，都可用无生命的培养基培养和分离。培养基的种类很多，可根据不同的病原体加以选用。培养分离病原体后，还可进行各种试验，如发酵试验、毒力试验等，这对病原体的进一步鉴定非常重要。病毒、衣原体和 立克次氏体缺乏维持生命所必须的各种酶，不能像细菌那样从培养基中摄取营养物质，利用自己的酶来合成自己所需的各种成分，不能用无生命的培养基培养,而必须接种到有生命的机体内,利用机体的酶来合成它们所需的各种成分。这种方法称“ 病毒分离”、“ 衣原体分离”或“ 立克次氏体分离”。
分离的方法一般有三种：
①组织培养。最简单常用；
②动物胚胎（如鸡胚、鸭胚）接种；
③动物接种，如接种小白鼠、豚鼠等。不同的病毒、衣原体或立克次氏体常需要不同的分离方法，分离 阳性后也常需进行各种试验（如 血清学试验等）才能最后判定其种类。病原体的直接检查常与病原体的培养分离同时进行。
除上述两种方法外，还有一些特殊的检查方法。例如对怀疑为的人或动物可取其 脑组织检查特异性包涵体（ 内格里氏小体）确诊；检查 乙型肝炎表面抗原可用反向被动血凝法(RPHA)酶联免疫吸附试验(ELISA)及放射免疫试验( RIA)等方法；检查粪便中的甲型肝炎病毒可用免疫电镜等。还可应用分子杂交或核酸分析的方法来检验病人血液、组织或排泄物中的病原体核酸以协助诊断，如血液中及肝组织中的乙型肝炎病毒核酸，就可用分子杂交的方法检测；粪便中的轮状病毒可用核酸分析的方法来检测等。由于病原体的各种抗原和病原体的核酸都是病原体的特异性成分，因此如果它们出现 阳性也就表示病原体阳性，故这些方法也具有很大的确定诊断的意义。
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