1.在电子显微镜中样本必须在真空中观察，因此无法观察活样本。随着技术的进步，环境扫描电镜将逐渐实现直接对活样本的观察；
2.在处理样本时可能会产生样本本来没有的结构，这加剧了此后分析图像的难度；
3.由于电子散射能力极强，容易发生二次衍射等；
4.由于为三维物体的二维平面投影像，有时像不唯一；
5.由于透射电子显微镜只能观察非常薄的样本，而有可能物质表面的结构与物质内部的结构不同；
6.超薄样品（100纳米以下），制样过程复杂、困难，制样有损伤；
7.电子束可能通过碰撞和加热破坏样本；
8.此外电子显微镜购买和维护的价格都比较高。
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