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荧光定量pcr的扩增步骤中,退火可以省略吗

2023.2.28
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超级艾蛋木啊

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一般不单独加退火温度,但其实并不是省略而是合并。一般来说PCR分为变性、退火、延伸三个步骤。变性是高温下DNA双链变成单链,退火是低温下引物跟DNA模板结合,延伸是聚合酶聚合形成新链。退火温度通常随引物Tm值(常为55-60℃)设定,延伸温度则普遍用72度(Taq酶,也就是DNA聚合酶活性最高的温度)。因为这三个步骤,我们也可以称它为三步法程序。相对应的,在qPCR实验中,我们最常见的是两步法程序,①变性,②退火+延伸。荧光定量的引物在设计时,Tm选择为60℃左右,而聚合酶在60℃也仍然有较高的聚合活性,因此他们就可以合并了。在60℃,既可以退火又可以延伸,想想是不是效率就很高了呢!当然,你想用三步法程序做定量也是没问题的,预实验摸好条件即可。

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