对靶序列中潜在的引物位点进行分析， 这些位点应该不会形成同源多聚体结构，也没有明显的形成二级结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。
（1）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物的熔解温度。
（2）选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的G+C含量相似，将产生一种大小和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的GC含量都应在40%-60%之间。
（3）对寡核苷酸的长度和/或位置进行细调。使得引物的3‘末端核苷酸为G或C。检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律，一条引物上不该含有三个连续的与另一条引物互补的核苷酸。
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