真菌毒素是严重危害人类健康和食品质量安全的一类天然毒素。我国对真菌毒素污染管控严格，先后四次颁布了食品中真菌毒素污染限量的强制性标准（GB 2761）。根据GB/T 5009，真菌毒素的主要检测方法是液质联用法（GC-MS）、液相色谱法（HPLC）、酶联免疫、薄层色谱法等；而一些行业标准和快检标准（KJ）又增加了胶体金免疫层析技术和时间分辩荧光免疫层析法等基于免疫检测的快速检测方法。免疫检测被广泛应用于市场监管和企业自检的第一道安全防线，满足现场快速筛查，市场需求极大。本文中，我们重点对2021~2023年我国真菌毒素检测市场主要快速检测技术进行分析和展示，帮助广大用户了解我国真菌毒素检测技术及产品特点，也为客户采购提供参考。
图1 黄曲霉毒素形态图
真菌毒素（Mycotoxin）一词源于希腊语“Mykes”和拉丁语“Toxicum”，它是由产毒真菌在适宜的条件下产生的有毒代谢产物。而真菌是以产生孢子的方式繁殖的真核生物。我们常听到、看到的“霉菌”并不是分类学上的名称，是菌丝体发达而又不形成较大子实体的一部分真菌的俗称。国内重点监管的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2（Aflatoxins，AFB1/ AFB2/ AFG1/ AFG2）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇[Deoxynivalenol，DON，又称呕吐毒素（vomintoxin）]、玉米赤霉烯酮 （Zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、T-2毒素（T-2 toxin）、展青霉素、伏马菌素等。随着技术的进步，而更多的真菌毒素的危害和检测方法也引起人们的关注，如铰链孢毒素等。动物食用被真菌毒素污染的饲料后，动物源性食品（如肉、奶、蛋）中就会含有对应真菌毒素的代谢物，最著名的是黄曲霉毒素B1的代谢物黄曲霉毒素M1。
真菌毒素污染是天然存在而不是人为作用的结果。据FAO报告，全球每年约有25%的农作物遭受真菌毒素的污染，其中2%的农作物因污染严重而完全失去营养价值和经济价值，由此造成的直接或间接经济损失达到数百亿美元。
图2 被黄曲霉毒素污染了玉米
真菌毒素常见暴露途径是被污染的食品或饲料，被人或动物摄取。黄曲霉毒素因污染最为广泛、对机体的危害最大而备受社会关注。1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构（IARC）划定为Ι类致癌物。
受气候、贮藏条件等的影响，我国是世界上被真菌毒素污染最严重的国家之一。我国每年因霉变而导致2500多吨粮食不能食用，出口粮食由于真菌毒素超过输入国限量标准而遭警告或降低等级的现象时有发生。
真菌毒素不会轻易消失。用污染了的粮食加工成食品或饲料后依然含有真菌毒素；食用了被真菌毒素污染饲料的畜禽产生的动物源性食品，会含有真菌毒素代谢物。脱毒也是真菌毒素研究领域的一个重要分支。真菌毒素暴露会引发急性或慢性疾病（如癌症）。需要强调的，食品单一而导致的长期低水平暴露不容忽视。
真菌毒素的危害已引起世界各国的重视，目前已有100多个国家/组织规定了食品中真菌毒素的限量。真菌毒素限量的设置与各国的经济发展水平及经济利益密切相关，是国际农产品贸易壁垒之一。一般来说，发达国家对真菌毒素限量水平要求极为严格，覆盖种类也更为丰富；而发展中国家设立的真菌毒素限量大多较为宽松，种类比较单一，一些落后国家甚至没有限量要求。对真菌毒素限量的强制性限定有助于推动真菌毒素检测方法的发展。
我国在曾多次颁布食品中真菌毒素限量的强制性标准：GB 2761-1985、GB 2761-2005、GB 2761-2011及GB 2761-2017，规定部分真菌毒素在不同食品的限量。从1985年版只规定黄曲霉毒素到2017年对六大真菌毒素做出限量规定，而在正在修订的GB2761征求意见稿中，又增加了伏马毒素的限量。在GB 2761-2017中，将食品分为22大类，每大类下分为若干亚类，依次分为次亚类、小类等。国际上将常见的食品污染物在各种食品中的限量要求，统一制定公布为食品污染物限量通用标准。如CAC制定公布的《食品和饲料中污染物和毒素通用标准》，涉及食品污染物、毒素和放射性核素限量规定；欧盟委员会No 1881/2006指令，规定了食品中特定污染物（含真菌毒素）限量；澳新食品标准局公布的《食品法典标准》的1.4.1《污染物及天然毒素》中规定了特定的金属和非金属污染物、天然毒素限量。而我国对真菌毒素污染与食品其他污染分别在不同标准中做了限定，一定程度上，反映了我国对真菌毒素污染的重视。
据Mordor Intelligence预测，真菌毒素全球检测市场在未来11年内以7.5%的复合年增长率增长，而亚太地区在2018年至2028年期间以最高的复合年增长率增长。北美在 2021 年的市场份额最高。根据EMR预测，预计在2023-2028年期间，全球霉菌毒素检测市场预计将以7.8%的CAGR值增长，到2026年将达到15.4亿美元。
全球真菌毒素检测市场份额占比最高是色质联用法（LC-MS/GC-MS），其次是免疫分析方法，高效液相色谱（HPLC）法排名第三。
图3 真菌毒素毒素检测市场占比情况
真菌毒素检测技术主要包括以现代色谱、色质联用法为代表的仪器分析方法及免疫检测为代表的快检方法等。其中，高效液相色谱法又包括柱前衍生和柱后衍生。在仪器分析前要进行待测物的提取，我们就先从样本前处理开始，详细介绍真菌毒素检测市场的主要方法。
由于一种作物（食品）可能被多种真菌毒素污染, 因此实现对多种真菌毒素同时检测或净化的技术具有很高的应用价值。虽然真菌毒素的污染具有样品选择性，但真菌毒素种类繁多，污染对象包括谷物、饲料、果蔬、加工食品、调料和中药材。
（1）各类净化柱
在样本前处理的净化过程中，需要用到各种净化柱提取待测物，主要有固相萃取柱（SPE）、免疫亲和柱（IAC）和多功能净化柱。为满足实际监测需要，目前的净化柱由净化一种或一类真菌毒素向多种类净化发展。近年来IAC在国际和国内都比较热门，是美国分析化学家协会（AOAC）、国际标准化组织（ISO）、欧盟标准（EN）及我国国家标准（GB）主要推荐的前处理方法。
图4 免疫亲和柱的净化流程
食品或饲料样品基质复杂，按照萃取的办法提取，步骤繁琐，时间长，而且提取效率不高。而免疫亲和柱依据抗原-抗体结合原理，样品溶液先过柱，再清洗、洗脱，可以获得净化效果很好的目标分析物溶液，极大的提高了检测效率，并具有环境友好性。提取的分析物可直接用于仪器检测。
国内IAC市场最初主要是由中检维康代理的VICAM垄断，在产品市场化的进程中，中检维康推动了免疫亲和柱联用HPLC检测的各类标准的制定。后来由北京华安麦科率先打破了国外产品的垄断，成功开发了IAC柱和多种类的净化柱（如ToxinFast@真菌毒素多功能净化柱），其他如普瑞邦、伊莱莎、易瑞、中检维康、苏微、维德维康、勤邦等国内企业都开始柱子的研发和生产。IAC柱要用到大量的单克隆抗体，生产IAC柱的企业要维护成本就需要有生产单抗的能力和设备，即需要有SPF级动物房、细胞培养室等。国内的一些科研院所，也关注真菌毒素多功能净化柱的研究，北京农林科学院质标所的王蒙研究员研制出3种高通量快速净化农产品中真菌毒素的前处理净化柱，并提出“一步净化”理论，使检测时间缩短了75%，成本降低了约80%。
图5 普瑞邦生产的各类免疫亲和柱
图6 深圳易瑞生产的黄曲霉毒素B1/B2/G1/G2净化柱
（2）自动化前处理设备
自动化前处理设备的技术原理，一些是基于固相萃取技术，另一些是基于免疫磁珠分离技术。免疫磁珠分离技术在上世纪末开始从应用研究走向产业化，并在近年来得到广泛的应用。它是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合，是一种特异性强、纯化度高的免疫学检测方法和抗原纯化手段。
国内的一些企业，分别推出了自动化前处理设备，如中检维康推出免疫磁珠自动工作站、普敦科技的全自动磁性固相萃取仪、莱伯泰科的SPE 1000全自动固相萃取系统等，都可用于真菌毒素污染样本的前处理。因为每种样品可能被不同的真菌毒素污染，所以前处理过程的统一是真菌毒素检测的发展趋势。
图7 中检维康的免疫磁珠自动工作站
在快检技术得到充分发展和应用的今天，仪器分析作为具有一种法检手段，在真菌毒素污染的确证实验中具有不可替代的作用。
根据GB 2761，大多数真菌毒素的检测限量是ng级的，对检测仪器没有特殊的要求，常规的荧光（或紫外）检测器即可满足限量要求。黄曲霉毒素是毒性最强的毒素，检测限量也是最低的。基于HPLC的分析中，检测黄曲霉毒素一般需要使用光学衍生器增加待测物的荧光信号，以获得更为灵敏的检测结果。因此，专注真菌毒素检测试剂或设备的公司，常会生产或销售光学衍生器。液相色谱配置的检测器价格相对便宜，可以满足基层或常规检测的需求。
图8 CLOVER光化学柱后衍生器
液质联用仪可以实现更加准确的定量分析，而且可以作为非定向筛查的手段，发现更多类型的毒素污染。此外，液质联用技术可以同时检测多种真菌毒素污染，一些行标都推荐了液相串联质谱检测谷物或饲料中多种真菌毒素的方法。
能够应用于真菌毒素液相色谱检测的主要品牌：沃特世、安捷伦、岛津、赛默飞、珀金埃尔默等，国内有华谱科仪等。
能够应用于真菌毒素液质检测的主要品牌有赛默飞、安捷伦、岛津、沃特世、珀金埃尔默和SCIEX等。
（1）免疫检测技术概述
免疫检测试剂是根据抗原-抗体竞争性结合原理开发的定量或定性快检产品。根据现行的《食品安全法》, 国家认可的快检方法可以作为执法依据，由此极大缩减了检测时间和提高了监管效率。早在2008年，由江苏省微生物所有限责任公司起草的GB/T 17480推荐了酶联免疫吸附法用于饲料黄曲霉毒素B1污染的检测；而GB 5009.22（24）-2106把酶联免疫吸附筛查法作为检测黄曲霉毒素B族和G族（M族）的标准检测方法。粮食行业标准在2015年将胶体金定量检测技术纳入标准中，而且即将颁布实施一系列时间分辨荧光免疫层析定量法。国家食药局于2017年、2019年和2022年先后颁布了8个真菌毒素的快检标准, 包括不同食品中呕吐毒素、黄曲霉毒素B1和M1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素的胶体金免疫层析法。这些都为免疫层析技术及产品在农业、粮油、食药行业的应用提供了技术保障和标准依据，满足田间、仓储、流通环节等现场快速筛查需要, 有效保障了这些领域真菌毒素污染的监管和检测, 在检测方法上实现了欧美国家同步。相信随着我国免疫层析技术的发展进步，有一天会登堂入室，跻身国标检测方法的。
按照技术出现的时间顺序，真菌毒素快检产品体系主要包括酶联免疫检测试剂盒、胶体金检测卡（试纸条）和时间分辨荧光定量检测卡等。我国曾经有一批只专注于真菌毒素检测试剂研发生产的企业，虽然目前无一不在拓宽检测领域，以应对更为复杂的市场竞争，但也在一定程度上说明真菌毒素检测在我国的规模化。
（2）酶联免疫检测试剂盒
近些年，酶联免疫试剂盒在食品质量安全检测领域的应用在缩减。究其原因是酶联免疫吸附技术对实验操作要求相对较高、费时、需要积累够一定数量的样本。而且近些年，粮食行业标准和国家市场监督管理局颁布、推荐的一系列快速检测标准方法中，几乎都是支持免疫层析技术的。但值得庆幸的是，酶联免疫法检测黄曲霉毒素B1和黄曲霉总量写进了《中国药典》（2020版第三部）中。中药材真菌毒素污染是近些年大家关注的重点，而真菌毒素污染对中药材质量安全的危害是非常致命的。
图9 勤邦生物黄曲霉毒素B1检测试剂盒
事实上，ELISA试剂盒在饲料质量安全检测中一直得到很好的应用，一旦检测样本超过十几个，其检测优势是非常明显的。河北伊莱莎生物技术有限公司是专注真菌毒素ELISA产品的公司之一，由其公司名称伊莱莎取自ELISA可知。当然，谈到真菌毒素ELISA检测，依然不能缺少华安麦科、苏微等老牌真菌毒素快检企业。
图10 苏微的真菌毒素检测试剂盒
（3）试纸条（检测卡）
试纸条是真菌毒素快检市场的主流产品，国外品牌主要有Romer （被帝斯曼收购）和Charm（中检葆泰代理）；国内知名品牌有华安麦科、易瑞、武汉维士康、维德维康、勤邦、河北伊莱莎等。但不同厂家在技术上又存在一定差异。就检测试纸条来说，以Charm为代表的胶体金产品是三条线，一条C线，两条T线（其中一条为校准T线），最后根据T/C的比值来定量，通过双T线保证产品的稳定性。其他厂家大多是两条线，一条C线，一条T线，定量也是根据T/C值来确定。
根据LS标准，应用于粮食领域的真菌毒素检测试剂需要实现定量检测，这在一定程度推动了食品安全免疫层析产品由定性检测向定量检测发展。Charm在中国的代理公司曾推动制定了四大真菌毒素胶体金定量检测技术的粮食行业标准 [LST 611（1~4）-2015年]。Charm胶体金定量检测试剂最早进入我国粮油真菌毒素检测市场，并在相当长的时间内处于垄断地位，粮食真菌毒素定量试剂一度成为快检产品中利润最高的。后来随着国内食品安全快检厂家的发展壮大和技术进步，华安麦科首先分得了第一杯羹，其后更多的企业开始进军粮油检测市场，但也带来同质化竞争，产品价格开始明显下降。而在农业、市场监管等其他领域，免疫层析技术主要以定性为主，企业竞争的市场机会受技术壁垒限制较小。
图11 Charm真菌毒素检测卡、读卡器和孵育器
试纸条需要在检测前，加入样品和金标抗体的孵育步骤，以克服检测灵敏度不足的问题，这是试纸条与检测卡的一个主要差异。因为真菌毒素检测的前处理过程，往往稀释倍数较高，对检测灵敏度要求更高，所以真菌毒素试剂的产品形式更多是试纸条。
近年来，伊莱莎推出了基于乳胶微球试纸条、手机版云E测（相当于读卡仪）和孵育器，实现对检测过程最大程度的简单化。值得重点强调的是，乳胶微球与抗体之间是化学键结合，抗干扰能力更强，稳定性和灵敏度更高，有利于建立稳定的检测体系；乳胶微球的灵敏度虽略低于荧光微球，但检测效果可视化、体系更加稳定、具有相对较宽的线性范围。
图12 伊莱莎乳胶微球真菌毒素免疫层析检测体系
（4）时间分辨荧光定量检测卡
虽然早在2014年，由李培武院士团队起草的NY/T 2548-2014，推荐了时间分辨荧光免疫层析法检测饲料及原料中黄曲霉毒素B1。但当时受产品等多种因素的限制，该标准推荐的技术并没有在饲料检测行业得到很好的贯彻和应用。
近年来，时间分辨荧光免疫层析定量法在粮油行业真菌毒素检测领域发展迅速，代表性事件是“LS/T 6143-2023 粮油检验 谷物中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析定量法”于2023年3月颁布，并将于同年9月实施。北京智云达科技股份有限公司作为LS/T 6143-2023唯一的试剂生产企业申请并参与了该标准的起草。该标准及后续一系列时间分辨荧光免疫层析技术LS/T的颁布实施，将结束持续8年的Charm为代表的胶体金定量检测方法在粮食行业、尤其在招投标中的绝对优势地位，虽然这两种免疫层析技术将在未来相当长的时间内并行，但其时代意义不容忽视，甚至可以说，对国内真菌毒素试剂生产有关企业来说，这是一个跨越式的进步。
图13 粮食行业标准“LS/T 6143-2023 粮油检验 谷物中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析定量法”文本首页
时间分辨荧光定量检测技术一般采用稀土元素铕（Eu3+）作为标记物，激发后荧光猝灭时间长，Stokes 位移宽达270 nm，通过时间分辨功能，消除背景荧光及激发光和发射光的互相干扰。Eu3+被聚苯乙烯纳米微球包裹后，再用葡聚糖修饰微球表面，可以大大提升微球的稳定性和对可逆环境的抗干扰性。因此，荧光定量免疫层析技术具有准确度高，稳定性和精密度好，线性范围宽等优点。时间分辨荧光检测卡的批内、批间差小，检测结果稳定，具有很高的检测灵敏度，弥补了免疫层析技术在灵敏度方面的弱势。但时间分辨荧光检测卡存在检测结果不直观的缺点，需要必须借助仪器才能读出。
图 14 荧光微球示意图
因为一种谷物可能被多种真菌毒素污染，统一前处理过程或统一提取液是真菌毒素快检试剂发展的趋势。而且提取液的主要成分也由过去的乙腈或甲醇，变成对免疫反应干扰小、环境友好的乙醇。
图15 维德维康的时间分辨荧光定量检测卡和检测仪
时间分辨荧光真菌毒素定量检测卡的厂家自上海飞测（南京微测）、苏微、智云达等开始，逐步又出现了维德维康、广东达元、北京纳迅、勤邦生物、河北伊莱莎等厂家，而且随着时间分辨荧光粮食行标的颁布实施，将会有更多的厂家会增加产品线。
图16 伊莱莎生产的时间分辨荧光定量检测卡
（5）检测仪器和检测箱
检测卡的定量检测结果需要依靠仪器读出，读卡仪内置标准曲线，可以直接得到待测样品中真菌毒素的浓度。目前市场上读卡仪兼具小型化、便携化、数据联网上传，直接打印等特点，而且发展趋势是多项目同时检测。
图17 北京纳迅时间分辨荧光定量检测仪器
在仪器小型化的基础上，厂家从客户需求着手，将包括前处理在内的整个检测过程所需的设备耗材，诸如：检测试剂、读卡仪、孵育器、移液器、粉碎机、计时器及各种耗材整合成检测箱，成为了一个移动的小型实验室，检测人员使用起来更加便利。
图18 南京微测的检测箱
（6）其他技术产品
真菌毒素快检产品是食品安全领域最丰富的。除了上述的产品和技术外，还有北京热景生物技术股份有限公司的上转换化学发光检测卡及拜发（biopharm）的化学发光成像检测试剂。
图19 热景生物的上转换发光检测卡
（7）标准物质和标准品
真菌毒素标准物质是快检产品开发和应用的前提，是检验快检产品准确度的保障，也是仪器分析和应用必须的。真菌毒素标准物质应该是天然阳性样本，不能简单的由标准品+空白样品制备。目前，只有很少的机构获得真菌毒素标准物质资质，包括国家粮食和物质储备局科学研究院和上海农科院。商业化销售有证标准物质（或质控样）主要有Romer公司和普瑞邦。此外，Romer和普瑞邦还拥有丰富的真菌毒素标准品，包括同位素内标。
图20 Romer的真菌毒素标准品
图21普瑞邦的真菌毒素标准品
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