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CRISPR/Cas9 靶点验证新选择
要说如今什么基因编辑技术最火，肯定非 CRISPR/Cas9 系统莫属了，从 google 学术搜索CRISPR相关文章找到了约 4.4W 篇。该基因编辑技术因其操作简便，编辑效率高，在医学和农学上得到广泛应用。
CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源 DNA。而CRISPR/Cas9 基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法。以CRISPR/Cas9 为基础的基因编辑技术在动植物基因组编辑以及一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。
CRISPR 序列由众多短而保守的重复序列区（Repeats）和间隔区（Spacers）组成。Repeats 含有回文序列，可以形成发卡结构。而 Spacers 比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas 系统就会予以精确打击。而在上游的前导区（Leader）被认为是CRISPR序列的启动子。
CRISPR 工作原理是 CRISPR-derived RNA (crRNA) 通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成 tracrRNA/ crRNA 复合体，此复合体招募 CRISPR 核酸酶聚集于 crRNA 配对的序列靶位点处，DNA 内切酶 Cas9 来对与 sgRNA20 个互补碱基的带有 PAM 结构的 DNA 进行剪切，细胞通过同源修复机制对断裂后的 DNA 双链进行修复，研究者可根据同源修复机制的原理，设计相关的实验对靶基因进行编辑（如：去除和/或添加新基因）。
图1 CRISPR结构
图2 CRISPR/Cas9 系统原理1
CRISPR/Cas9 靶点验证常见的方法包括酶切和 Sanger 测序法。两者前期实验基本一致，通过PCR扩增带有突变位点的目的片段，再利用核酸内切酶进行酶切验证靶点是否成功编辑。Sanger 测序可以很直观的通过碱基的变化和峰图的变化来确定靶点是否成功编辑。与这些方法相比，因 Qsep 系列全自动毛细管电泳仪具有高灵敏度和高分辨率的特点，用来验证靶点省时省力，结果更可靠
图3 CRISPR/Cas9 靶点检测结果
图4 酶切产物结果
1.Fuguo Jiang and Jennifer A. Doudna, CRISPR–Cas9 Structures and Mechanisms, Annual Review of Biophysics 2017 46:1, 505-529.
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