文章标题：Reno-Protective Effect of Low Protein Diet Supplemented With α-Ketoacid Through Gut Microbiota and Fecal Metabolism in 5/6 Nephrectomized Mice
发表期刊：Frontiers in Nutrition
影响因子：6.59
作者单位：复旦大学附属闵行医院
百趣生物提供服务：非靶标代谢组学，16S
代谢组学分享—研究背景
代谢组学分享，慢性肾病(Chronic kidney disease, CKD)影响着全球近8.5亿人，其发病率和死亡率都很高。经研究发现，低蛋白饮食(low protein diet, LPD)通过减轻肾小球高滤过产生氮废物的工作状态，延缓CKD发展。代谢组学分享，鉴于LPD存在潜在副作用，如氨基酸供应不足和营养不良，补充α-酮酸（一种必需氨基酸的无氮替代物）的LPD(LKD)被应用于延缓CKD的发展。
且研究表明，LKD在减少代谢负担、对肾组织氧化应激的保护作用和血压控制方面比LPD更有效。而LPD和LKD延缓CKD发展的机制尚不清楚。代谢组学分享，近年来，许多研究报道肠道菌群失调会改变宿主代谢组，并影响人类和啮齿动物的肾功能衰竭和CKD并发症。
膳食结构的组成和变化对肠道菌群的结构和代谢有着深远的影响。结肠是大多数肠道菌群生长和代谢的地方，尽管5-10%的膳食氨基酸会到达结肠，但许多膳食微生物组研究通常集中在膳食纤维、脂肪和碳水化合物的影响上。关于膳食蛋白质对CKD肠道菌群和代谢的具体影响知之甚少。代谢组学分享，LKD是CKD治疗的基石，而LKD-微生物代谢相互作用在CKD发病和治疗中的机制作用仍不清楚。因此，作者对5/6肾次全切除术(5/6Nx)诱导的CKD小鼠采用不同的喂养方法，探讨了LKD和LPD对肠道菌群和粪便代谢的影响。
代谢组学分享—研究设计
见图1A，其中Sham组为假手术组，即肾脏没有被切除的小鼠组；NPD组为正常蛋白质饮食的5/6Nx小鼠组；LPD组为低蛋白质饮食的5/6Nx小鼠组；LKD组为补充α-酮酸的低蛋白质饮食的5/6Nx小鼠组。
代谢组学分享—研究结果
LKD缓解了5/6Nx小鼠的肾功能衰竭 与Sham组相比，NPD组的体重明显减轻（图1B），而LPD组和LKD组似乎并没有体重减轻。由图1C-E可知，NPD组中24小时尿蛋白、血清肌酐(SCR)和血尿素氮(BUN)的水平显著高于Sham组的结果，证实CKD模型成功（所有p<0.0001）。与NPD组相比，LKD组中的SCR水平显著降低，但在LPD组中没有改变。与NPD组相比，LPD组的BUN水平均显著降低。代谢组学分享，此外，Sham组小鼠肾脏组织中肾小球和肾小管结构正常，小鼠肾脏病理改变结果与肾功能改变结果一致（图1F）。其中，CKD组均有不同程度的肾间质纤维化、大量淋巴细胞浸润、肾小管肿胀、坏死。代谢组学分享，与NPD组相比，LPD组和LKD组肾组织损伤程度明显改善，淋巴细胞浸润和肾小管病变明显减少，尤其是LKD组。
图1
LKD改善5/6Nx小鼠的肾纤维化和炎症 为了进一步验证LKD和LPD是否可以延缓5/6Nx诱导的肾功能衰竭的发展，作者进行了Masson、Sirius red染色和α-SMA抗体的免疫组织化学观察CKD小鼠的肾纤维化程度（图2A-C）。结果表明，LKD和LPD显著改善了CKD小鼠的纤维化程度，尤其是LKD。代谢组学分享，由于CKD通常伴有微炎症状态，作者检测了血清中的三种炎症因子（IL-6、TNF-α和IL-1β）以评估炎症水平（图2D-F）。与Sham组相比，NPD组的IL-6、TNF-α和IL-1β均显著增加，表明微炎症状态。与NPD组相比，LPD和LKD的IL-6、TNF-α和IL-1β均显著降低。此外，LKD组中的IL-6显著低于LPD组，表明LKD组具有更好的抗炎能力。
图2
5/6Nx和LKD对肠道菌群的影响
鉴于5/6Nx和不同饮食会对肠道菌群产生影响，作者探索了不同组间小鼠肠道菌群的结构和差异。如图3B所示，NPD组的Chao1和Shannon均显著低于sham组，且Chao1显著低于LKD组。这表明5/6Nx会降低肠道菌群的丰富度和多样性，而LKD减弱了5/6Nx引起的肠道菌群丰富度降低的影响。代谢组学分享，非度量多维尺度分析(NMDS)分析（图3C）显示，Sham组与NPD组、LPD组和LKD组显著分离，相距较远。
LPD组和LKD组的聚类圈较近且远离sham组和NPD组。这表明，与5/6Nx相比，改变饮食方式对肠道菌群整体结构的影响更大。NPD组与Sham组相比，厚壁菌门的数量增加且厚壁菌门与拟杆菌门的比例（F/B）显著高于Sham组；而LKD组与NDP组相比，厚壁菌门的数量减少且LKD组的F/B比率低于NPD组（图3D-E）。这些结果表明，四组小鼠的肠道微生物群在多样性和结构上都存在差异，且LKD组可能通过增加微生物丰富度和降低F/B比来改善5/6Nx引起的菌群失调。
图3
5/6Nx对粪便代谢组的影响 对粪便进行代谢组学检测分析发现，5/6Nx显著改变了粪便代谢物的代谢模式（图4C），并且这些差异代谢物主要是有机酸及其衍生物（30.1%）、脂质和类脂分子（24.2%）和有机杂环化合物（22.3%）。代谢组学分享，为了探究差异代谢物的功能意义，通过代谢通路富集分析，发现差异代谢物主要富集在各种氨基酸的生物合成与代谢通路（图4D）。
图4
LKD对5/6Nx小鼠粪便代谢组的影响 由于LKD对5/6Nx的治疗效果优于LPD，作者进一步分析了LKD组、NPD组和LPD组粪便代谢物的差异，以探讨其作用机制。代谢组学分享，结果表明，与NPD组相比，LKD组的粪便代谢物显著不同，并且这些差异代谢物主要由脂质和类脂分子（21%）、有机酸及其衍生物（20%）、有机杂环化合物（20%）、有机氮化合物（8.7%） 等组成（图5C）。LKD组和LPD组之间的差异代谢物主要由脂质和类脂分子（34.3%）、有机杂环化合物（23.2%）、有机酸及其衍生物（17.1%）、有机氮化合物（8%）等组成（图6C）。 LKD组和NPD组之间的差异代谢物主要富集在各种氨基酸的代谢通路（图5D），而LKD组和LPD组之间的差异代谢物主要富集在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路（图6D）。
图5
图6
鉴定与LKD相关的关键OTU和代谢物 图7A-D显示了差异丰度的操作分类单元(OTU)及其数量。图7E表明，有13个OTU为LKD特异性差异OTU，可延迟5/6Nx诱导的肾功能衰竭。代谢组学分享，图7F表明，有五种常见的通路被确定为与LKD延缓5/6Nx诱导的肾功能衰竭相关的的关键通路，分别是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；甘油磷脂代谢；鞘脂代谢；维生素B6代谢和嘌呤代谢。
图7
多组学分析揭示了LKD、肠道菌群和粪便代谢组之间的关联
为了进一步探索LKD的机制，作者进行了多组学分析，将关键的粪便代谢物与关键OTU和CKD相关参数（肾功能和炎症因子）进行了关联分析（图8A）。由图可知，一些关键OTU与粪便代谢物显著相关，这表明LKD诱导的肠道菌群的改变可能会影响粪便代谢。
由图8B桑基图中可知，s_Parabacteroides_sp_CT06(OTU_47),s_Mucispirillum_sp_69(OTU_926),g_Akkermansia(OTU_131)和g_Lachnoclostridium(OTU_63)是影响粪便代谢组的四种主要生物标志物。PC(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/16:0)（参与甘油磷脂代谢）与CKD相关参数呈负相关。代谢组学分享，参与嘌呤代谢的黄嘌呤和次黄嘌呤与CKD呈正相关。吡哆醇、吡哆醛和4-吡哆酸（参与维生素B6代谢）与CKD呈负相关。脱氢鞘氨醇和鞘氨醇（参与鞘脂代谢）与CKD呈正相关。L-苯丙氨酸和L-酪氨酸（参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成）与CKD呈正相关。这些结果表明，参与甘油磷脂、嘌呤、维生素B6、鞘脂、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的特定代谢物以及与LKD相关的微生物与CKD的改善相关。
图8
代谢组学分享—总结
作者将小鼠5/6肾切除后给予正常蛋白饲料(NPD)组、低蛋白饲料(LPD)组和低蛋白饲料加α-酮酸(LKD)组，8周后，采集血液、肾组织和粪便进行生化分析、组织学、肠道菌群的16S rRNA序列和非靶标粪便代谢分析。代谢组学分享，得出以下结果：
（1）LKD和LPD都减轻了5/6肾切除小鼠的肾衰竭和纤维化以及炎症状态，尤其是LKD。
（2）在肠道微生物组方面，LKD显著改善了5/6Nx引起的菌群失调。
（3）5/6Nx和LKD显著改变了粪便代谢组。
（4）参与甘油磷脂、嘌呤、维生素B6、鞘脂、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的特定代谢物以及与LKD相关的微生物与CKD的改善相关。
总的来说，LKD在延缓5/6肾切除术所致CKD肾功能衰竭方面的效果优于LPD，这可能与影响肠道微生物组和粪便代谢组的调节有关。
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