肿瘤早期诊断之多重生物标志物检测法

    统计，我国每年新患癌症的病人约160万人，每年因癌症死亡的人数约130万人。我国大、中城市居民的许多死亡原因中，癌症是第一位死因。世界卫生组织作出最新权威性结论，癌症患者如能早期发现，治愈率可达80%以上。因此，进行癌症的早期诊断是非常必要的。癌症早发现、早治疗可以减轻患者的痛苦和精神、经济负担。

    目前，癌症早期诊断包括物理指征、生化指标和肿瘤标志物检测等多种方法，其中肿瘤标志物检测具有高效、快速、高通量的特点，并且非侵入式检测大大降低了患者的痛苦。

    肿瘤标志物的分泌来源于肿瘤微环境的基质细胞以及肿瘤细胞，存在于细胞、组织或体液中，能用化学或免疫方法定量证实肿瘤存在，监测肿瘤治疗和预后的物质。

    目前为止，还没有找到灵敏度、特异性100%的肿瘤标志物。单一指标、单一因子的检测很难准确的实现肿瘤早期检测、病程监控及预后治疗效果的评估等。如传统的Elisa方法，仅能进行单一蛋白因子的检测。若要提高检测的准确性和特异性，需要进行多个Elisa实验检测不同的蛋白因子。以10个蛋白因子检测为例，需要10个Elisa试剂盒，至少1ml的样本，一周时间才能得到结果。无论从人力、财力还是时间和样本量来说，都不是很好的选择。而且10个因子不是同时检测也可能造成结果的误差。

图1 检测对象选择越丰富疾病区分度越好（class代表指标分类，marker代表具体指标）

    目前看来，多因子联合检测的方法不仅可以用少量样本，在最快的时间内筛选肿瘤标志物，还可以大大提高肿瘤早期诊断的准确性和特异性。下面我们就列举几篇文献，说明Milliplex高通量多因子检测平台在肿瘤早期诊断中的快速，高效和准确性。

1  Milliplex多因子检测平台在卵巢癌早期诊断中应用

Diagnostic Markers for Early Detection of Ovarian Cancer

Irene V, Ziding F, Gary L, et al. [J]. Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 2008, 14(4):1065-1072.

实验设计：

样本：362例健康对照和156例确诊卵巢癌样本分为两组（检测组和验证组）

方法：使用Milliplex技术检测血清样本中6种蛋白因子leptin, prolactin, MIF, osteopontin, IGF-II和CA-125表达水平。

图二：Milliplex 与 ELISA比较，对于所有标志物的检测呈现很好一致性

图三：6种血清标志物的表达水平

图四：6种标志物的ROC曲线

 结果和意义：

• - 非侵入性方法（血清）对肿瘤进行早期诊断。

• - 多种因子联合检测提高了检测特异性。

• -  Milliplex和ELISA 在不同因子的检测上数据具有很高一致性，反应出相同的趋势。

• - 6种标志物联合检测的诊断价值（灵敏度95.3%，特异性 99.4%）显著高于CA-125(灵敏度72%，特异性95%)检测效果。

2  Milliplex在肺癌早期诊断中应用

A multi-analyte serum test for the detection of non-small cell lung cancer.

Farlow, E.C., Vercillo, M.S., Coon, J.S., et al. British Journal of Cancer 2010; 103(8):1221.

实验设计：

样本：评价90例非小细胞肺癌（NSCLC）和43例non-cancer对照样本

方法: Millipore Milliplex 多因子检测方法分析血清中47种标志物。多变量统计方法（Multivariate statistical methods）确定NSCLC最佳的诊断标志物组合.

图五：6种标志物通过Random Forest 算法获得的algorithm盒形图（Box plots）

图六：6 种血清标志物的 ROC曲线

结果和意义：

• - 6种标志物 (TNF- a, CYFRA 21-1, IL-1ra, MMP2-2, MCP-1 and sE-selectin)的组合能够作为NSCLC早期诊断的最有效标志物，能够从88例病人中成功的筛选出75例。

• - 开发出新的血清学算法，针对非小细胞肺癌（NSCLC）病人中的“high-risk”个体具有高特异性。

3  Milliplex在乳腺癌早期诊断中应用

Detection of serum VEGF and MMP?9 levels by Luminex multiplexed assays in patients with breast infiltrative ductal carcinoma

Zhang J, Yin L, Wu J, et al. Detection of serum VEGF and MMP-9 levels by Luminex multiplexed assays in patients with breast infiltrative ductal carcinoma.[J]. Experimental & Therapeutic Medicine, 2014, 8(1):175-180.

实验设计：

材料：301 breast cancer 样本, 83 例乳腺纤维性瘤（breast fibroadenoma）样本和40例健康对照样本

方法：Milliplex液相芯片技术检测上述术前血清 VEGF和MMP-9的表达水平及118例乳腺癌术后血清 VEGF 和 MMP-9 表达水平

图七：不同组间样本血清(A)VEGF和(B)MMP-9的表达水平

图8：IDC 病人和健康对照样本血清(A)VEGF和(B) MMP-9 ROC曲线下面积

结果和意义：

• - 乳腺浸润性导管癌（breast infiltrative ductal carcinoma，IDC)病人血清VEGF和 MMP?9 水平高于乳腺纤维性瘤和健康对照样本(P<0.05); p="">0.05).

• - VEGF 和 MMP?9的表达与肿瘤临床分期，肿瘤大小和淋巴结转移具有相关性. 与病人的年龄，性别无相关性 (P>0.05).

• - 血清MMP?9与VEGF表达水平具有显著相关性 ( P<0.001). 组内分析显示IDC病人血清VEGF 和MMP?9术前表达水平显著高于术后 (P<0.05).

• - 血清 VEGF 和 MMP?9能够作为乳腺IDC诊断标志物；对于淋巴结转移也有重要的预测价值。

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