Cell Metabolism｜一种新的阿尔茨海默症治疗策略？

2019.8.09

麦特绘谱生物科技(上海)有限公司

阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，其中β淀粉样蛋白（Aβ）聚集会导致神经元丢失以及随后的记忆障碍。小胶质细胞，一种大脑固有免疫细胞，监控环境从而维持大脑稳态。AD中，小胶质细胞可对Aβ产生炎症表型反应，并清除这些毒性聚集物。韩国首尔国立大学研究团队发现Aβ急性干预可诱导小胶质细胞激活，该过程中伴随着从氧化磷酸化（OXPHOS）到糖酵解的代谢重编程。然而，长期暴露于Aβ中，小胶质细胞整体代谢出现缺陷。总的来说，代谢重编程对小胶质细胞功能至关重要，调节小胶质细胞代谢可能是AD的一种新的治疗策略。该成果发表在《Cell Metabolism》。（文末有下载原文方式）

Aβ诱导小胶质细胞急性炎症，并伴有OXPHOS到有氧糖酵解的代谢重编程

为研究小胶质细胞对Aβ的反应，培养新生小鼠脑组织中原代小胶质细胞（PMG），用不同形式的Aβ处理PMG 24个小时，包括Aβ单体（mAβ）、Aβ寡聚体（oAβ）和纤维型Aβ（fAβ），以大肠杆菌产生的脂多糖（LPS）作为阳性对照。结果显示，所有形式的Aβ均改变了小胶质细胞的形态。Aβ处理的小胶质细胞的吞噬活性比对照组增加一倍。此外，Aβ处理显著增加了促炎细胞因子蛋白（Fig. 1A）和mRNA（Fig. 1B）的表达，其作用与LPS相当，但对抗炎细胞因子水平无影响（Fig. 1B）。这表明，Aβ诱导小胶质细胞急性炎症与免疫反应增强有关，说明Aβ作为危险信号被小胶质细胞识别。

由于免疫细胞的状态可以通过细胞代谢情况进行评价，于是采用实时细胞外通量分析监测PMG在12小时内的代谢动力学。暴露于Aβ 2小时后，小胶质细胞实时细胞外酸化率（ECAR）（一种糖酵解测定方法）急剧上升达到平衡期并维持10小时，表明糖酵解代谢发生了根本转变（Fig. 1C）。通过测定糖酵解主要副产物乳酸的水平，进一步证实了Aβ诱导的小胶质细胞糖酵解水平增加（Fig. 1D）。与对照组相比，Aβ处理组小胶质细胞线粒体的最大呼吸能力显著降低（Fig. 1E）。活细胞成像结果也表明，在炎性免疫细胞（如小胶质细胞）中Aβ会导致线粒体分裂（Figure 1F），并参与破坏电子传递链。因此，在Aβ诱导的炎症激活过程中，小胶质细胞的代谢从OXPHOS转变为有氧糖酵解（Warburg效应）。

炎症细胞因子IL-1β在Aβ处理后2小时出现并逐渐增加，而此时糖酵解达到峰值（Fig. 1G），由此，研究人员假设糖酵解是启动和维持小胶质细胞炎症所必需的。为了验证这一点，用2-脱氧-D -葡萄糖（2-DG，一种抑制糖酵解的葡萄糖类似物）处理暴露于Aβ的PMG。结果显示，炎症细胞因子IL-1β和TNF-α在Aβ + 2-DG处理的细胞中表达水平明显低于仅Aβ处理的细胞（Figure 1H）。综上所述，Aβ可促进有氧糖酵解和炎症细胞因子的释放，同时抑制了与线粒体形态改变相关的OXPHOS，表明有氧糖酵解的代谢重编程是调节Aβ诱导的小胶质细胞炎症激活的关键过程。

Aβ诱导的糖酵解和炎症依赖于mTOR-HIF-1α通路

mTOR通路调节葡萄糖代谢作为感知细胞能量状态的部分机制。那么，mTOR通路是否参与了Aβ诱导的代谢重编程呢？研究人员对Aβ处理后PMG中AKT-mTOR-HIF-1α和AMPK-mTOR-HIF- 1α通路的状态进行检测分析。免疫印迹分析结果显示，Aβ诱导AKT磷酸化和AMPK去磷酸化，进而引发mTOR磷酸化（Fig. 2A），以及mTORC1下游的p70S6K和4E-BP1磷酸化。值得注意的是，Aβ显著提高HIF-1α的表达，其水平与LPS组相当（Fig. 2A）。这些结果表明，暴露于Aβ的小胶质细胞中促进糖酵解的mTOR-HIF-1α通路上调。此外，雷帕霉素（mTOR变构抑制剂）或二甲双胍（AMPK激活剂和mTOR抑制剂）可抑制mTOR通路，降低Aβ诱导的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达（Fig. 2B）。因此，Aβ诱导的小胶质细胞炎症依赖于mTOR通路。

Aβ可诱导小胶质细胞先天免疫耐受和代谢缺陷

由于AD是一种慢性疾病，因此还需进一步考察Aβ对小胶质细胞激活过程的长期作用。oAβ或对照刺激PMG 24小时后，洗净药物继续培养3-5天，然后再用oAβ或对照刺激24小时。实验分为三组：Veh、急性组和慢性组。结果显示，慢性组促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白水平低于急性组，甚至与未受处理组水平相当，而慢性组抗炎细胞因子IL-10和IL-1RA的表达未受影响（Fig. 3A 和3B）。而且，慢性组小胶质细胞的吞噬活性显著降低（Fig. 3C），表明Aβ最终会诱导小胶质细胞出现先天免疫耐受性。诱导小胶质细胞急性炎症的AKT-mTOR- HIF-1α通路在慢性组中下调（Fig. 3D），最终导致乳酸产量下降到与未处理组相当的水平（Fig. 3E），说明糖酵解代谢出现缺陷。与急性组一样， Aβ耐受的小胶质细胞仍存在线粒体功能障碍（Fig. 3F）。此外，长期暴露于Aβ会轻微增加小胶质细胞坏死，但不会导致细胞凋亡。综上所述，Aβ耐受的小胶质细胞存在包括糖酵解和OXPHOS在内的细胞代谢缺陷，并导致小胶质细胞功能受损。

体内实验证实Aβ诱导急性炎症和耐受性

为研究小胶质细胞在体内对Aβ有何反应，研究人员对7.5个月野生型小鼠（WT）进行脑室内（ICV）注射PBS或oAβ，24小时后分离小胶质细胞并进行全基因组RNA测序（RNA-seq）。结果显示，与PBS处理的WT小鼠（WT + PBS）相比，Aβ处理的WT小鼠（WT + Aβ）的小胶质细胞中上调基因373个，下调基因72个（Fig. 4A）。上调基因富集出169条生物过程（BP），KEGG通路16条，而下调基因中没有。前15条BPs（Fig. 4A）和KEGG通路（图S4B）均与“炎症”和“免疫功能”有关。因此，体内急性暴露Aβ可诱导小胶质细胞炎症，增强免疫反应。

那么，7.5月龄5XFAD小鼠（AD转基因小鼠模型）大脑中的小胶质细胞对Aβ会有什么反应呢？研究发现，与PBS处理（5XFAD+PBS）相比，Aβ处理的5XFAD（5XFAD+Aβ）小鼠大脑中小胶质细胞中有187个上调基因和104个下调基因（Fig. 4B），并在上调基因中发现46条显著富集的BPs和12条KEGG通路。虽然5XFAD+Aβ小鼠中BPs与WT + Aβ小鼠有一定的重叠，但BPs的种类及其相关性是大大降低的（Fig. 4B）。经Aβ处理后，WT与5XFAD小鼠的前20个富集的BPs具有明显的差异（Fig. 4C）。与此同时， BPs的全基因组转录谱（“炎症反应”、“先天免疫反应”、“细胞因子反应”、“细胞趋化”和“免疫系统调节”；Fig. 4D），以及与炎症反应相关基因（Il1b、Tnf、Tlr4、Ccl7、Ccl2和Cxcl2；Fig. 4E）表明，与WT小鼠相比，5XFAD小鼠大脑中的小胶质细胞几乎不被激活，对Aβ的反应也较弱。

在WT和5XFAD小鼠中，Aβ对小胶质细胞基因的调控有何差异？结果显示，与5XFAD +Aβ小鼠相比，WT +Aβ小鼠的小胶质细胞中上调更显著的基因富集出785条BPs和52条KEGG通路。在前20个BPs中，“细胞代谢过程”、“初级代谢过程”、“有机物代谢过程”和“生物合成过程”，包括“碳水化合物代谢过程”、“碳水化合物衍生物的生物合成过程”最为显著（Fig. 4F）。此外，与“炎症”和“免疫功能”相关的基因本体论(GO)分类排在前20个BPs（Fig. 4F），并在KEGG通路中显著富集。综上所述，在代谢和免疫上，WT小鼠的小胶质细胞比5XFAD小鼠更易被Aβ激活，并且与WT小鼠相比，7.5月龄的5XFAD小鼠大脑中的小胶质细胞具有Aβ耐受性和代谢缺陷。

体内小胶质细胞的反应依赖于糖酵解代谢，AD转基因小鼠模型中存在缺陷

有研究表明，小胶质细胞在激光消融后迅速向损伤部位募集，因此，研究人员对小胶质细胞特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）的Cx3cr1^gfp/+小鼠进行了活体多光子显微镜（IV-MPM）延时脑成像。结果显示，消融后小胶质细胞立即向损伤部位扩展，这个过程在60分钟内达到了顶峰（Fig. 5A，PBS处理的对照小鼠）。小胶质细胞的这种反应是一种即时的、快速的免疫反应，但需要产能的突然激增，因此假设这种反应依赖于糖酵解。为了验证这一点，对Cx3cr1^gfp/+小鼠全身注射2-DG阻断糖酵解后的小胶质细胞反应进行分析。有趣的是，2-DG阻断糖酵解后并不能消除小胶质细胞的运动稳态，而向损伤部位趋化的过程则明显减缓（Fig. 5A，2-DG处理的小鼠）。

采用相同的激光消融方法， ICV注射PBS或oAβ 24小时后，分析Cx3cr1^gfp/+小鼠小胶质细胞运动过程。注射oAβ的小鼠中，损伤部位的募集过程明显稍微快一些（Fig. 5B）。6-8个月大的5XFAD/Cx3cr1^gfp/+小鼠的小胶质细胞对激光诱导损伤的反应结果显示，AD转基因小鼠的小胶质细胞反应活性显著降低（Fig. 5C）。综上所述，AD转基因小鼠体内长期接触Aβ，会导致小胶质细胞对体内损伤的反应降低。研究人员推测，小胶质细胞功能损害可能是由Aβ诱导的代谢缺陷引起的。值得注意的是，在小胶质细胞运动过程中起着关键作用的嘌呤受体P2Y12在斑块相关的小胶质细胞中是下调的。而Aβ处理组和5XFAD组小鼠的小胶质细胞P2ry12的表达均未显著下降，Aβ处理的小鼠的小胶质细胞过程的募集速度要快于对照组小鼠。这些结果表明体内小胶质细胞反应是由糖酵解代谢驱动。

IFN-γ可以修复受损的细胞代谢、mTOR信号传导以及Aβ耐受的小胶质细胞的免疫功能

AD中的小胶质细胞因代谢障碍而功能失调，那么代谢增强是否可以挽救AD中受损的小胶质细胞功能？研究人员用IFN-γ（一种炎症细胞因子，能激活mTOR通路，促进先天免疫细胞的糖酵解代谢）处理小胶质细胞。结果显示，重组IFN-γ使oAβ诱导的小胶质细胞最大糖酵解能力增加一倍。大脑中编码IFN-γ受体的Ifngr1和Ifngr2基因在小胶质细胞中表达程度远高于其他类型细胞。有趣的是，AD转基因小鼠模型大脑中细胞因子IFN-γ的水平很低。因此，IFN-γ被认为是一种具有治疗AD潜力的“代谢促进”药物。那么IFN-γ促进Aβ耐受小胶质细胞代谢能否挽救受损的小胶质细胞功能呢？研究显示，与对照处理耐受PMG相比，IFN-γ处理可提高AKT-mTOR磷酸化水平和HIF-1α表达（Fig. 6A），从而改善受损的糖酵解代谢（Fig. 6B），随后炎症反应增强（Fig. 6C和6D）。IFN-γ注射全身是否也会影响5XFAD小鼠的小胶质细胞过程运动？6-8个月龄5XFAD/Cx3cr1^gfp/+小鼠IV-MPM成像显示，IFN-γ诱导的代谢增强可以挽救激光损伤引起的受损小胶质细胞反应（Fig. 6E）。综上所述，重组IFN-γ处理Aβ耐受小胶质细胞，可促进受损的mTOR-HIF-1α通路和糖酵解代谢，恢复免疫反应包括促炎细胞因子的分泌、吞噬活性和体内趋化。

慢性IFN-γ干预可增强AD转基因小鼠的小胶质细胞功能减轻AD病症

AD小鼠模型中IFN-γ慢性干预有何作用？首先，利用IV-MPM成像技术对5XFAD/Cx3cr1^gfp/+小鼠（6月龄）全身注射IFN-γ前后的大脑小胶质细胞和Aβ斑块进行监测。研究发现，IFN-γ干预增加了小胶质细胞对Aβ斑块的激活和募集，Aβ斑块周围小胶质细胞体积增加（Fig. 7A）。然后，对5XFAD小鼠（4.5 ~ 7.5月龄）进行长期（3个月）IFN-γ干预，并对处死后的脑组织进行分析。研究表明，IFN-γ比PBS组更能使5XFAD小鼠的小胶质细胞募集到Aβ斑块（Fig. 7B的箭头和7C）。值得注意的是，IFN-γ干预组所有小胶质细胞都含有较高数量的胞内Aβ（Fig. 7B的白箭头和7D），其中CD68+吞噬溶酶体增加，表明细胞变得更有活性和吞噬性。因此，在IFN-γ组中，小胶质细胞吸收的Aβ总量明显大于PBS组小鼠（Fig. 7E），小鼠Aβ斑块负担降低（Fig. 7F）。脑组织免疫印迹分析显示，IFN-γ处理引起的Aβ斑块减少与Iba-1升高有关，这说明小胶质细胞增生增强，但不能反映出APP或PS1表达改变（Fig. 7G）。小胶质细胞通过覆盖Aβ斑块来保护神经元免受Aβ诱导的神经毒性。研究发现，IFN-γ处理后Aβ斑块的小胶质细胞覆盖率增加。此外，在IFN-γ处理的小鼠中，突触素表达增加的趋势不明显（Fig. 7G；p = 0.0843），而神经元密度显著增加（Fig. 7H）。IFN-γ处理后，5XFAD小鼠认知功能的受损得到了恢复（Fig. 7I），说明促进体内代谢可通过增强小胶质细胞功能逆转AD病症。

小结

这项研究证明了代谢重编程是Aβ诱导小胶质细胞炎症的基础，Aβ耐受的小胶质细胞在5XFAD小鼠模型中表现出代谢功能障碍。研究人员证实，直接调节细胞代谢对小胶质细胞的表型变化有两个方面的影响：激活和失活，即抑制mTOR通路和糖酵解可显著降低Aβ诱导的小胶质细胞炎症反应，而用IFN-γ促进糖酵解代谢则恢复了小胶质细胞的运动，增加Aβ的吞噬作用。该研究揭示了细胞代谢通路与小胶质细胞功能表型之间的密切关系，但为了更好地理解大脑病理过程中小胶质细胞的代谢功能障碍，还需要进一步的研究。而对小胶质细胞生物能量通路的调控，可能是阿尔兹海默症和其他神经退行性疾病有前景的一种治疗策略。

参考文献

Baik et al., A Breakdown in Metabolic Reprogramming Causes Microglia Dysfunction in Alzheimer’s Disease, Cell Metabolism (2019), https://doi.org/10.1016/j.cmet.2019.06.005.

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