酵母双杂交应用解析

上海欧易生物医学科技有限公司

2019.3.01

蛋白与蛋白互作的研究方法中，酵母双杂交体系是很受欢迎的。但是在实验完成后怎样进行数据整理，使文章结构更完整。今天小编结合一篇发表于Plant Physiology上的文章（文末有链接），带大家梳理一下。

首先是，当实验做完数据统计发现内容不够怎么办？在蛋白选择上，有木有做到以下几点。

如果你只有一个诱饵蛋白，做完筛选后，是否有继续将其结构域进行细分研究？

是否有向其互作基因的家族进行延伸研究？

是否有对其近缘物种或模式生物的相同基因进行比较研究？

例如在该文章中，作者对水稻基因OsPHO2 与OsTrxh1、 OsTrxh4是否有互作进行研究时，在构建载体时先使用了全长序列作为诱饵进行文库筛选，结果这两个基因被筛选到，显示互作。同时作者又克隆了Trxh家族的其他基因，与OsPHO2进行一对一验证。得到了OsPHO2 可以结合Trxh1和 Os Trxh4，但是不能结合 Os Trxh3/h5/h6/h7/h8/h10的结果。

从整个蛋白，进一步细化到功能域。作者将OsPHO2分成了N端（1-633 aa)和C端(589-876 aa）两部分，继续进行互作研究，确定其作用的具体位置（文中后半部分甚至细化到了蛋白的单个motif--WCGPC，在此不进行赘述）。

除了纵向研究水稻中PHO2与Trxh家族的互作关系外，作者还横向比较了拟南芥中At PHO2与 At Trxh2/h7/h8的互作关系。

第二，酵母双杂交体系是存在假阳性概率的。所以完整有说服力的研究是需要结合多种方法互相佐证的。比如BiFC，Co-IP，pull-down等蛋白互作方法。在该文中作者通过BiFC证明了OsPHO2-OsTrxhs在水稻原生质体中存在互作。通过pull-down证明了OsPHO2-OsTrxhs的体外互作。另外，在酵母双杂交体系中，有可能因为表达载体上的核定位信号或者细胞结构不同等原因，使原物种细胞中定位于不同时空的蛋白，在酵母细胞中表达后被拉到同一细胞核或相近位置中，由于空间上接近而产生假阳性互作。基于此，通过蛋白亚细胞定位研究，可以从空间上佐证蛋白互作的真实性。在该文章中，作者通过亚细胞定位发现，OsPHO2主要定位于ER，OsTrxh1 主要定位于细胞质、细胞核；OsTrxh4主要定位与细胞质和ER。另外通过引用相关文献报道的OsTrxh1 也会分泌到胞外，间接证明其来源于粗面ER。从空间上证明了蛋白互作的可能性。

最后，通过对所研究基因的野生型、突变型和互补型株系的基因表达量、生长形态、生理生化指标进行检测，使研究更接近于生产应用，也是极好的。该文章中检测了wild type Nipponbare (Nip), pho2 mutant,和complemented lines的叶片含磷量，对比分析了其生长形态差异，宏观上研究了OsPHO2的作用。最后的最后，在研究总结部分，一定不要忘记绘制信号通路图，意义你懂得。

▷▷文献引用

Ying Y , Yue W , Wang S , et al. Two h-Type Thioredoxins Interact with the E2 Ubiquitin Conjugase PHO2 to Fine-Tune Phosphate Homeostasis in Rice[J]. Plant Physiology, 2017, 173(1):812.

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