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动脉粥样硬化是目前世界上第一大死亡原因，目前，其治疗主要依靠他汀类降胆固醇药物，这类药物靶向效率低、水溶性差、体内清除快，在实际应用中仍面临许多残留风险。阿托伐他汀(AT)虽然极高剂量的口服给药可以减少小鼠体内斑块的形成，但肝毒性和肌病的不良反应使其无法用于人体。这使得目前尚无有效的靶向治疗策略。

本研究描述了一种被Mø-RBC复合膜包裹的负载阿托伐他汀(AT)的仿生纳米材料，该纳米材料中，巨噬细胞膜可延长AT的循环半衰期，增强AT在动脉粥样硬化斑块中的积累。体内体外实验确定该纳米材料的有效性和安全性，并通过转录组学和代谢组学等实验对其潜在功效机制进行了探究。

1. [Mø−RBC]m和HA-M@AT@GP的制备与表征

作者将巨噬细胞（Mø）膜和红细胞（RBC）膜融合得到[Mø−RBC]m用于包裹GOQDs-PEG纳米材料（GP NPs），随后，将透明质酸（HA）插入复合膜形成的HA-M@AT@GP具有良好的稳定性。同时，细胞膜涂层对pH依赖的AT释放方式没有影响，对动脉粥样硬化的有效治疗有很大帮助，并发现Møm修饰能有效延长纳米材料的血液循环半衰期，提高纳米材料的靶向能力（图1 ），复合膜有效地保持了Møm的固有功能。最后，生物相容性测试发现复合膜对HA-M@AT@GP的血液稳定性和血液相容性具有优势，有利于临床应用。

图1  [Mø−RBC]m和HA-M@AT@GP的制备与表征

2. 细胞摄取HA-M@AT@GP

作者发现RAW264.7细胞对HA-M@GP的吞噬能力显著降低，表明在原始细胞膜蛋白的帮助下，复合膜可以显著避免免疫监测，并且活化巨噬细胞能够有效摄取HA-M@GP(图2A、B)。作者采用能够抑制不同内吞作用的小分子抑制剂来说明HA-M@AT@GP的摄取机制，发现HA-M@AT@GP进入细胞后可以部分绕过溶酶体，同时，HA-M@AT@GP可以减少药物在酸性环境中的降解，从而发挥更大的功效。

图2 HA-M@AT@GP有激活巨噬细胞的靶向能力

3. HA-M@AT@GP的体外抗动脉粥样硬化作用

实验发现HA-M@AT@GP可以减轻LPS诱导的炎症和清除氧化应激（图3C-E）。细胞摄取和内化氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是泡沫细胞形成的重要过程——动脉粥样硬化病变的标志，而AT可减轻这一过程。实验数据表明HA-M@AT@GP可以通过减少细胞摄取和内化ox-LDL来抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞的形成，说明HA-M@AT@GP在动脉粥样硬化治疗中具有巨大的潜力（图3F-I）。

图3  HA-M@AT@GP的体外生物学效应

4. 低剂量HA-M@AT@GP的体内疗效

作者对高脂饮食处理的小鼠进行静脉注射HA-M@AT@GP以评估对病情发展的疗效（图4A），发现随着HA-M@AT@GP在斑块中的积累， ORO的阳性面积显著减少（图4B、C）。H&E染色等结果显示HA-M@AT@GP预防了早期动脉粥样硬化小鼠的斑块发展，从而降低心肌梗死的风险（图5A-F）。血清ELISA数据显示, HA-M@AT@GP能显著抑制动脉粥样硬化小鼠促炎细胞因子的分泌，并促进抗炎细胞因子的分泌（图5G-K）。这些数据表明，HA-M@AT@GP可通过减轻全身炎症有效减轻动脉粥样硬化病变。

图4  HA-M@AT@GP治疗可有效抑制小鼠早期动脉粥样硬化的进展

图5  HA-M@AT@GP预防了早期动脉粥样硬化小鼠的斑块发展

5. 高剂量的体内疗效HA-M@AT@GP

作者使用晚期动脉粥样硬化小鼠模拟临床患者，评估了HA-M@AT@GP治疗动脉粥样硬化的可行性，发现HA-M@AT@GP处理可减轻动脉粥样硬化病变程度（图6B-G）。同时，H&E染色等数据也显示HA-M@AT@GP在晚期动脉粥样硬化治疗中的显著作用（图7），并能有效地降低全身炎症。相比于口服高剂量药剂，静脉注射纳米材料可以通过可控释放和靶向给药来降低毒性作用。

图6  HA-M@AT@GP治疗可有效抑制小鼠的晚期动脉粥样硬化进展

图7  HA-M@AT@GP在小鼠晚期动脉粥样硬化中可以消退斑块面积和减少炎症

6. HA-M@AT@GP的潜在功效机制

动脉粥样硬化是一种以脂质内流和胆固醇外排失衡为特征的疾病，作者发现HA-M@AT@GP可以通过抑制炎症相关粘附分子的分泌，减少额外单核细胞的募集和动脉粥样硬化斑块泡沫细胞的形成。WB和ELISA分析显示HA-M@AT@GP可以通过调节NF-κB/NLRP3通路抑制脂质内流，有效延缓动脉粥样硬化的进展(图8A)。HA-M@AT@GP还可以通过调节AMPK/mTOR/自噬信号通路促进胆固醇外排，从而有效地缓解晚期动脉粥样硬化(图8)。代谢组学分析显示，与模型组相比，HA-M@AT@GP组在正、负离子模式下分别注释了652、342个代谢物。KEGG通路分析结合转录组数据表明HA-M@AT@GP可通过调节精氨酸代谢、NO-cGMP-PKG信号通路和苯丙氨酸代谢，减少脂质内流，促进胆固醇外排，从而缓解动脉粥样硬化（图9）。

图8  HA-M@AT@GP可以减少炎症，增强自噬

图9 代谢组学数据

本研究中，作者描述了一种被Mø-RBC复合膜包裹的负载AT的仿生纳米材料，它能有效地治疗动脉粥样硬化。这种复合膜覆盖策略不仅保留了纳米药物对内皮系统的免疫逃逸和在炎性动脉粥样硬化斑块中的活性积累，而且还增加了纳米药物对斑块的渗透。同时，HA修饰可以进一步提高动脉粥样硬化斑块中活化巨噬细胞对纳米药物的摄取效率。动脉粥样硬化斑块的酸性环境促进药物的释放，使斑块内长期保持高水平的药物浓度，从而使病变部位保持高药物浓度。在长期低剂量治疗和短期高剂量治疗过程中，其安全性也得到了验证。作者通过转录组学、代谢组学和WB等技术对HA-M@AT@GP的潜在功效机制进行了探究。这种微环境响应的仿生给药系统可以通过替换细胞膜类型和药物，作为治疗其他炎症性疾病的替代策略。

胃癌(GC)已成为全球第六大常见癌症，虽然胃癌的治疗方案很多，但是胃癌患者的生存率仍然很低。因此，探索GC的发生机制，寻找治疗GC的新靶点至关重要。甲基转移酶3(METTL3)介导的N6-甲基腺苷(M6A)RNA修饰已被证明是促进胃癌(GC)的一个潜在因素。METTL3通过修饰多种mRNAs调控一系列信号转导通路，而可介导什么途径还需探索。

该研究运用免疫沉淀，WB，ELISA和非靶向代谢检测等技术手段确定了新的METTL3介导的信号通路，并探索可能的靶点用于胃癌的临床环境。

1. METTL3加速胃癌的恶化

作者为了探索METTL3在体内对肿瘤细胞增殖和转移的影响，用METTL3 shRNAs或对照shRNAs(ShNC)处理MGC803细胞。在异种移植模型中，与阴性对照相比METTL3基因敲除的细胞在肿瘤体积和重量方面均显著变小(图1A-C)。IHE显示，METTL3基因敲除后，增殖生物标记物Ki67减少(图1D)。此外，生物发光成像和H&E染色显示，METTL3基因敲除显著抑制了体内肺转移(图1E-G)。鉴于淋巴转移是胃癌最常见的转移方式，作者建立了一种足-窝淋巴结转移模型(图1H)。8周后，METTL3细胞敲除组小鼠的窝淋巴结体积明显小于阴性对照组(图1I、J)。H&E染色显示，METTL3基因敲除组的淋巴结转移百分率较低(图1K、L)。这些结果表明METTL3在体内外均能促进GC的增殖和侵袭。

图1 METTL3基因敲除在表型及组织层面的影响

2. METTL3通过m⁶A修饰调节Pbx1基因的稳定性

为了探讨METTL3在胃癌发生发展中的分子机制，作者结合RNA-seq进行了MERIP-seq。结果发现有7个基因重叠(图2A)，用qPCR方法检测了其在METTL3(wt和突变体)中mRNA的水平，结果发现METTL3敲低后只有ZNF668和PBX1转录水平显著下调，反之上调，但不受突变METTL3水平的影响（图2B）。作者使用siRNAs在过表达METTL3的AGS和MKN1细胞中靶向Pbx1，并通过WB定量Pbx1蛋白水平。Pbx1的敲除显著抑制了METTL3过表达促进的增殖、迁移和侵袭能力的提高。结果表明，Pbx1是METTL3调控胃癌恶性过程的靶基因。MERIP分析表明， METTL3介导的m⁶A修饰通过影响Pbx1mRNA的稳定性来调节Pbx1的水平（图2F-I）。

图2 METTL3介导PBX1mRNA的m6A修饰分析

3. Pbx1作为转铁蛋白诱导GC中GCH1的表达

为了解Pbx1在GC发生发展中的作用，作者收集10例GC患者的肿瘤和癌旁组织，WB显示大多数肿瘤组织中METTL3、Pbx1和GCH1蛋白水平升高(图3A)。METTL3以介导m6A的方式诱导GCH1的mRNA和蛋白水平(图3B)。相反，在AGS和MKN1细胞中敲除METTL3显著抑制GCH1水平(图3C、D)。经Pbx1特异性siRNA处理后，GCH1显著降低。此外，STM2457对METTL3的催化抑制显著降低了Pbx1和GCH1的蛋白水平(图3E)。临床样本胃癌组织中METTL3和GCH1的蛋白水平高于正常佐剂组织(图3F)。这些结果表明，METTL3-PBX1轴诱导了GCH1在GC中的表达。通过特定的siRNAs阻断AGS细胞中Pbx1的表达，发现Pbx1的敲除消除了METTL3对GCH1表达的促进作用(图3G)，说明METTL3调控GCH1是通过PBX1介导的。PBX1是调控GCH1的转录因子，因此，GCH1是METTL3-Pbx1轴的直接下游基因。

图3 METTL3-PBX1 轴上调 GCH1 基因转录分析

4. BH4是METTL3-Pbx1-GCH1途径的效应分子

由于GCH1是BH4生物合成的第一个限速酶(图4A)，作者测量METTL3过表达或下调的细胞裂解物BH4水平，发现METTL3基因敲除BH4表达下调 (图4B、C)。此外，Pbx1的敲除使得细胞内BH4水平下调(图4D)。结果说明，METTL3-Pbx1介导GCH1蛋白调节GC细胞BH4的生物合成。作者通过非靶向代谢组以验证BH4处理的AGS细胞中的代谢差异。共有1097种代谢物被注释到苯类、核苷、核苷酸类似物、类脂和类脂分子等不同分类。这些数据表明BH4是METTL3-PBX1GCH1轴的效应分子。

图4 METTL3-PBX1轴上调BH4诱导GC细胞ELISA及代谢分析

5. METTL3-Pbx1-GCH1轴促进BH4诱导胃癌恶化

最后，作者根据CCK-8和Transwell分析，发现BH4可显著增强AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并可修复由METTL3基因敲除引起的增殖和转移缺陷(图5A、B)。相反，BH4合成的小分子抑制剂SPRi3严重损害了细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并抑制METTL3过表达导致的促进增殖、迁移和侵袭的作用(图5C、D)。用异种移植模型验证SPRi3对细胞增殖的抑制作用。结果表明，SPRi3阻断了METTL3对肿瘤生长的促进作用(图5E、图F)。结果说明，BH4的生物合成是通过METTL3-Pbx1-GCH1轴诱导的，在体外和体内都促进了GC的进展。

图5 METTL3 介导BH4 合成促进 GC 的发展

本研究中，作者的数据显示，METTL3以m⁶A依赖的方式调控潜在的癌基因PBX1的表达。此外，PBX1还参与了GCH1表达的升高。METTL3-PBX1-GCH1轴控制BH4的合成，促进GC细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，靶向METTL3-PBX1 GCH1轴为胃癌治疗提供了一种潜在策略。

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