cDNA文库构建可以:(1)用于分离全长基因进而开展基因功能研究;(2)筛选目的基因并直接用于表达;(3)提供构建分子标记连锁图谱的所用探针。
实验方法原理 | cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、Superscipt II—RT合成第一链
1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water
(大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链,第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。)。
2. 混匀后,70℃反应10分钟。
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
(1)4 ul 5×first strand buffer
(2)2 ul 0.1 M DTT
(3)1 ul 10 mM dNTP(自己配制)
5. 混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀。
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):
(1)20 ul 10×DNA Polymerase I buffer
(2)6 ul 10 mM dNTP(自己配制)
(3)xul dd H2O
(4)1 ul RNase H(2 U/ul)
(5)10 ul DNA Polymerase I(10 U/ul)
总体系为200 ul。
2. 混匀后,16℃反应2.5小时。
3. 70℃灭活10分钟。
4. 反应完成后,得到200 ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上。
5. 取2 ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder,确定双链的大小范围。
注:一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些。
三、 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
(1)6 ul 10 mM dNTP
(2)2 ul T4 DNA Polymerase(8.7 U/ul)
(3)2 ul BSA(10 mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物,37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟。
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13 000 g离心5分钟。
4. 离心后,吸取上清于另一1.5 ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13 000 g离心5分钟。
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V 3M NaAc(PH5.2)和2.5 V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA。
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13 000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA。
7. 离心完毕,弃上清,加入1 ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13 000 g离心5分钟。
8. 离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味。
注:第3,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
四、PCR纯化试剂盒操作流程
1. 溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。
2. 向200 ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB,混匀。
3. 加入spin column中,13 000 rpm离心1 min。
4. 加入0.75 ml buffer PE,13 000 rpm离心1 min。
5. 13 000 rpm,再离心1 min。
6. 将spin column放入一新的离心管中,加入50 ul buffer EB,静置10 min。
7. 13 000 rpm离心2 min。
8. 加入30 ul buffer EB,静置10 min。
9. 13 000 rpm离心2 min。
10. 加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。
五、 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9 ul EcoR I adaptor(400 ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀。
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
(1)1.2 ul 10×Ligase Buffer
(2)1 ul 10 mM rATP
(3)1 ul T4 DNA Ligase(4 U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days或者8℃过夜连接。
六、 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase。
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
(1)1 ul 10×Ligase Buffer
(2)1 ul 10 mM rATP
(3)6 ul dd H2O
(4)1 ul T4 PNK(10 U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟。
4. 稍微离心使反应物集中至管底。
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
(1)4 ul Xho 10×Buffer
(2)2 ul BSA
(3)5ul ddH2O
(4)8ul Xho I (10 U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟。
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
七、胶回收cDNA
1. 配制小胶数板(每个样品一板):1%琼脂糖凝胶,2 ul EB/300 ml 胶。
2. 取4℃保存样品上样,40 ul/孔。
3. 电泳50 V,1 h。
4. 紫外灯下分别切下500~1 kb、1.0-2.0 kb及2.0-4.0 kb cDNA 片段.,分别放入已做标记的1.5 ml离心管中。
5. 称取胶重,加入三倍体积buffer QXI(例如,100 mg胶中加入300 ul buffer QXI)。
6. 50℃ 水浴数分钟,至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬,每管中加入5 ul QIAEXII。
7. 50℃ 水浴10 min,每隔2 min 取出颠倒混匀数次,使QIAEX II 保持悬浮。
8. 4℃,13 000 rpm,30 s (弃上清,离心机中甩一下,吸取上清)。
9. 加入500ul buffer QXI,轻弹管底使QIAEX II 重悬。
10. 离心并去上清(同操作8)。
11. 加入500 ul buffer PE,重悬QIAEX II,离心30 s,去上清。
12. 再加入500 ul buffer PE,重悬QIAEX II,离心30 s,弃上清,离心机中甩一下,吸去上清。
13. 超净台上吹干(至无乙醇味),加入10 ul elution buffer,重悬QIAEX II,静置5 min,13 000 rpm,30 s。吸上清,冰上放置。
14. 取1 ul上清上样电泳,同时做分子量标准(1 kb ladder)及DNA含量标准(10 ng,20 ng)作对照。
15. 将收回的cDNA置于-20℃内保存,据电泳结果,取适量DNA进行连接。 收起 |
注意事项 | 1. RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定)。 5. 胶回收前电泳槽,电泳板,梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
6. 胶回收时电压要稳定。 |
其他 | 一、cDNA构建成功关键因素
构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多,在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录,这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好,虽然后者也并不是不能做。
2. 反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键
这是构建cDNA文库中最贵的一步,也是核酸质变的一步,它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功,说明一次文库方案的夭折。
3. 层析柱cDNA分级很关键
这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心,尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作,cDNA的加入和收集要精力集中。
噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高,也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功,更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。 |